Modellazione e imaging 3-Dimensional Invasion cella Collettiva
Summary
Modelli di invasione delle cellule tumorali in tre dimensioni della matrice extracellulare meglio riflettere la<em> In vivo</emSituazione> quelli a due dimensioni saggi di motilità. Usando saggi invasione matrice combinata con l'imaging confocale di cellule fluorescenza-etichettato, informazioni dettagliate sulle modalità di invasione e il contributo distinto di leader rispetto ai seguenti cellule possono essere ottenuti.
Abstract
Una caratteristica distintiva della malignità del cancro è l'invasione e metastasi 1. In alcuni tipi di cancro (e. g. Glioma 2), invasione locale nel circostante tessuto sano è la causa principale di malattia e morte. Per altri tipi di tumore (e. g. Mammella, polmone, ecc.), È il processo di metastasi, in cui le cellule tumorali passare da una massa tumorale primaria, colonizzare siti distale e in ultima analisi, contribuire alla insufficienza d'organo, che alla fine porta a morbilità e mortalità 3. E 'stato stimato che l'invasione e le metastasi sono responsabili del 90% delle morti per cancro 4. Di conseguenza, vi è stato intenso interesse per individuare i processi molecolari e mediatori proteina critica di invasione e metastasi ai fini del miglioramento della diagnosi e del trattamento 5.
Una sfida per gli scienziati è quello di sviluppare il cancro test invasione che sufficientemente simile alla situazione in vivoper permettere la modellazione accurata della malattia 6. Bidimensionale saggi di motilità cellulare sono solo informativi circa un aspetto della invasione e non tengono conto della matrice extracellulare (ECM) rimodellamento proteina che è anche un elemento critico. Recentemente, la ricerca ha raffinato la nostra comprensione di invasione delle cellule tumorali e ha rivelato che le singole cellule possono spostare da modalità allungate o arrotondate 7. Inoltre, vi è stata maggiore apprezzamento per il contributo di invasione collettiva, in cui le cellule invadono in fili, fogli e dei cluster, in particolare nei tumori altamente differenziate che mantengono le caratteristiche epiteliali, per la diffusione del cancro 8.
Vi presentiamo un metodo raffinato 9 per esaminare il contributo delle proteine candidate per invasione collettiva 10. In particolare, le piscine di ingegneria separati di cellule di esprimere diverse proteine fluorescenti, è possibile sezionare molecolarmente le attività e PROTEIns richiesto nelle cellule principali rispetto a quelli richiesti nelle cellule seguito. L'uso di RNAi fornisce lo strumento molecolare di smontare sperimentalmente i processi coinvolti nell'invasione delle cellule individuali così come in diverse posizioni di invasione collettiva. In questa procedura, le miscele di cellule fluorescenza marcata sono placcati sul fondo di un inserto Transwell precedentemente riempiti con proteine Matrigel ECM, poi il permesso di invadere "verso l'alto" attraverso il filtro e nel Matrigel. Ricostruzione delle serie Z stack immagine, ottenuta da imaging confocale, in rappresentazioni tridimensionali permette la visualizzazione di collettivamente fili invadere e analisi della rappresentazione di cellule fluorescente-etichettato leader contro seguenti posizioni.
Protocol
Discussion
Saggi di invasione Matrigel sono tradizionalmente stati istituiti con le cellule posto su uno strato di proteine della matrice extracellulare con chemoattractant indotta motilità verso e attraverso un filtro in basso. L'invasività è stata valutata in funzione del numero di cellule potevano contare sulla parte inferiore del filtro. Anche se in pratica vi è poca differenza con il saggio "inversa" invasione di cui sopra, ci sono informazioni molto più sul processo di invasione che può essere deter…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il finanziamento per questa ricerca è da Cancer Research UK.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | GIBCO | 21969 |
| Fetal Bovine Serum | PAA | A15-101 |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140 |
| 200 mM L-Glutamine (100x) | GIBCO | 25050-032 |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 |
| 0.05% Trypsin EDTA | GIBCO | 25300 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | AL-118 |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 |
| 6.5mm Transwells, 8.0 µm pore size | Corning | 3422 |
| Complete Matrigel | BD Biosciences | 354234 |
| Calcein AM | Invitrogen | C1430 |
| RNase | Qiagen | 19101 |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 |
| Confocal microcope | Leica | SP2MP |
References
- Olson, M. F., Sahai, E. The actin cytoskeleton in cancer cell motility. Clin. Exp. Metastasis. 26, 273-287 (2008).
- Hoelzinger, D. B., Demuth, T., Berens, M. E. Autocrine factors that sustain glioma invasion and paracrine biology in the brain microenvironment. J. Natl. Cancer. Inst. 99, 1583-1593 (2007).
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, 1559-1564 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The Hallmarks of Cancer. Cell. 100, 57-70 (2000).
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Methods. Enzymol. 406, 625-643 (2006).
- Croft, D. R., Olson, M. F. Regulating the conversion between rounded and elongated modes of cancer cell movement. Cancer Cell. 14, 349-351 (2008).
- Wolf, K. Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion. Nat. Cell. Biol. 9, 893-904 (2007).
- Hennigan, R. F., Hawker, K. L., Ozanne, B. W. Fos-transformation activates genes associated with invasion. Oncogene. 9, 3591-3600 (1994).
- Scott, R. W. LIM kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells. J. Cell. Biol. 191, 169-185 (2010).
