Neste protocolo um método para medir refolding proteína intracelular após choque térmico é descrito. Este método pode ser usado para estudar foldases como chaperonas moleculares e seus co-fatores ou compostos capazes de influenciar a sua actividade. Firefly luciferase atividade é utilizado como repórter para medir a atividade refolding acompanhante.
Este protocolo descreve um método para medir a atividade enzimática de chaperones moleculares em um sistema baseado em células e os possíveis efeitos de compostos com atividade inibitória / estimulante. Chaperones moleculares são proteínas envolvidas na regulação do enovelamento de proteínas 1 e têm um papel crucial na promoção da sobrevivência celular após insultos estresse, como choque térmico 2, a fome de nutrientes e exposição a produtos químicos / venenos 3. Por esta razão chaperones são encontrados para ser envolvido em eventos como o desenvolvimento do tumor, chemioresistance das células cancerosas 4, bem como neurodegeneração 5. Desenho de pequenas moléculas capazes de inibir ou estimular a atividade destas enzimas é, portanto, uma das estratégias mais estudadas para terapia de câncer e doenças neurodegenerativas 7 9. O ensaio aqui descrito oferece a possibilidade de medir a atividade refolding de um chaperone molecular particular e para estudar o efeito da compounds sobre a sua actividade. Neste método o gene da chaperone molecular investigado é transfectadas com uma codificação de vetor de expressão para o gene luciferase vaga-lumes. Já foi descrito que a luciferase firefly desnaturado podem ser reabertos por chaperones moleculares 10,11. Como normalizar o controle de transfecção, uma codificação de vetor para o gene luciferase é renilla transfectadas. Todos os transfections descritos neste protocolo são realizadas com X-treme Gene 11 (Roche) em células HEK-293. Na primeira etapa, a síntese protéica é inibida pelo tratamento das células com cicloheximida. Posteriormente proteína desdobramento é induzida por choque térmico a 45 ° C por 30 minutos. Após a recuperação, a 37 ° C, as proteínas são re-dobrada em sua conformação ativa e da atividade da luciferase firefly é usado como ler-out: quanto mais luz será produzido, o mais proteína terá re-ganhou a conformação original. Não-calor células chocado são definidos como referência (100% de refoldedluciferase).
Neste trabalho um protocolo para medir a atividade refolding intracelular de chaperones moleculares é apresentado. O ensaio completo pode ser realizado em 3 a 4 dias como mostra a visão geral na fig. 1.
A robustez ea linearidade do sinal de luz produzida pelo vaga-lume ea luciferase renilla representam uma base sólida para a reprodutibilidade do protocolo.
A etapa crítica do ensaio é a escolha de um reagente de transfecção eficiente para g…
The authors have nothing to disclose.
Danilo Maddalo é beneficiário de uma bolsa de pesquisa no Grupo de Jovem Pesquisador (YIG) do Instituto de Tecnologia de Karlsruhe.
For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer ‘1420 Luminescence Counter’ Vector Light′ was used
Programs for the Luminometer:
Renilla: Pump 1, 100 μl injection
Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection
Luciferin: Pump2, 30μl injection
For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water:
GLY-GLY-buffer:
For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter.
Reaction buffer for Renilla/Coelenterazine buffer:
For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH2PO4 solution, 86,6ml of a 1M K2HPO4 solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution.
Company | Catalog/Product Number: | |
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium 1X) | GIBCO | 41966029 |
Fetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 |
X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent |
Roche | 06365809001 |
PBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1X |
GIBCO | 14190-094 |
MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid |
SIGMA-ALDRICH | M1254 |
Cycloheximide | SIGMA-ALDRICH | C7698 |
Passive Lysis Buffer 5X | Promega | E194A |
Glycylglycin |
SIGMA-ALDRICH Roth Roth |
G7278 3054.2 P027.1 |
KH2PO4 |
Roth Roth Roth Roth |
3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 |
Luciferin Firefly | Biosynth | L8200 |
Coelenterazine | Biosynth | C7000 |
DTT (Dithiothreitol) | Roth | 6908.2 |
ATP (Adenosine Triphosphate) | Roche | 10519987001 |