Внутриклеточное Пробирной рефолдинг

Summary

В этом протоколе метод измерения внутриклеточного белка рефолдинг после теплового шока описан. Этот метод может быть использован для изучения foldases как молекулярных шаперонов и их ко-факторы или соединений, способных влиять на их деятельность. Firefly активности люциферазы используется в качестве репортера для измерения активности шаперона рефолдинг.

Abstract

Этот протокол описывает метод для измерения ферментативной активности молекулярных шаперонов в клеточной системе и возможные последствия соединений с тормозным / стимулирующей деятельности. Молекулярная шаперонов являются белки, участвующие в регуляции сворачивания белка ¹ и играют решающую роль в обеспечении выживаемости клеток на стресс оскорбления, как тепловой шок ^2, питательных голода и воздействия химических веществ / яды ^3. По этой причине шаперонов оказываются вовлечены в события, как развитие опухоли, chemioresistance раковых клеток ^4, а также нейродегенеративные ^5. Дизайн малых молекул способен подавлять или стимулировать активность этих ферментов является одной из наиболее изученных стратегий для лечения рака ⁷ и нейродегенеративные расстройства ^9. Анализ описанных здесь предлагает возможность измерения рефолдинг деятельности частности молекулярный шаперон и изучение влияния компounds о своей деятельности. В этом методе ген молекулярных шаперонов исследуемый трансфицированных вместе с кодировкой вектор экспрессии для генов люциферазы светлячка. Это уже описано, что денатурированный люциферазы светлячка можно сложил на молекулярных шаперонов ^10,11. Как нормализации трансфекции контроля, вектор кодировки для renilla люциферазы гена трансфекции. Все трансфекции, описанные в этом протоколе выполнены с X-Treme Ген ¹¹ (Roche) в НЕК-293 клеток. На первом этапе, синтез белка подавляется обработки клеток циклогексимид. После разворачивания белка индуцирована теплового шока при 45 ° С в течение 30 минут. После восстановления при 37 ° C, белки заново сложить в их активную конформацию и активность люциферазы светлячка используется в качестве считывания: больше света будет произведено, тем больше белка будет повторно приобрел оригинальную конформацию. Номера для тепла шокированы клетки устанавливаются в качестве справочных (100% сложиллюциферазы).

Protocol

1. Посев клетки Перед началом разминки культуральной среде, PBS 1X и трипсина в водяной бане при температуре 37 ˚ C Возьмите клеток из инкубатора и аспирата среды. Осторожно применять 5 мл ФСБ 1X на клетки, чтобы вымыть их. Аспирируйте PBS 1X и закапывать по 1 мл трипсина соде…

Discussion

В этой работе протокол для измерения активности внутриклеточных рефолдинг молекулярных шаперонов представлена. Весь анализ может быть выполнен в 3-х до 4 дней, как показано на рис обзор. 1.

Надежность и линейность световой сигнал, и светлячка renilla люциферазы пред…

Materials

For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer ‘1420 Luminescence Counter’ Vector Light′ was used

Programs for the Luminometer:

Renilla: Pump 1, 100 μl injection

Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection

Luciferin: Pump2, 30μl injection

For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water:

• –       1M MgSO₄ : 246,48g MgSO₄*7H₂O in 1 liter
• –       0,5M EGTA: 190,18g EGTA in 1 liter
• –       1M KH₂PO₄: 136,09g KH₂PO₄ in 1 liter
• –       1M K₂HPO₄: 228,23g K₂HPO₄*3H₂O in 1 liter
• –       5M NaCl: 292,2g NaCl in 1 liter
• –       0,5M EDTA: 186,12g EDTA*2H₂O in 1 liter          

GLY-GLY-buffer:

• –       25mM Glycylglycin
• –       15mM MgSO₄
• –       4mM EGTA

For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter.

Reaction buffer for Renilla/Coelenterazine buffer:

• –      13,4mM KH₂PO₄
• –       86,6mM KH₂PO₄
• –       0,5M NaCl
• –       1mM EDTA

For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH₂PO₄ solution, 86,6ml of a 1M K₂HPO₄ solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution.

	Company	Catalog/Product Number:
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium 1X)	GIBCO	41966029
Fetal Bovine Serum Gold	PAA	A15-151
X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent	Roche	06365809001
PBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1X	GIBCO	14190-094
MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid	SIGMA-ALDRICH	M1254
Cycloheximide	SIGMA-ALDRICH	C7698
Passive Lysis Buffer 5X	Promega	E194A
Glycylglycin EGTA MgSO4 (MgSO4*7H2O)	SIGMA-ALDRICH Roth Roth	G7278 3054.2 P027.1
KH2PO4 K2HPO4 (K2HPO4*3H2O) NaCl EDTA	Roth Roth Roth Roth	3904.1 6878.2 3957.1 8043.1
Luciferin Firefly	Biosynth	L8200
Coelenterazine	Biosynth	C7000
DTT (Dithiothreitol)	Roth	6908.2
ATP (Adenosine Triphosphate)	Roche	10519987001