Germ Cell Transplantation und Hodengewebe in Mäusen Xenografting

Summary

Protokolle für die Keimzelle der Transplantation und Hodengewebe Xenografting werden beschrieben. Germ-Transplantation führt zu Donor-derived Spermatogenese in den Empfängerländern Hoden und eine funktionelle Rekonstitution Assay für die Identifizierung von Spermatogonien-Stammzellen (SSC). Hodengewebe Xenografting reproduziert Hodenentwicklung und Spermatogenese verschiedener Spender Arten in Empfängermäuse.

Abstract

Keimzelle der Transplantation wurde von Dr. Ralph Brinster und Kollegen an der University of Pennsylvania im Jahr 1994 ^1,2 entwickelt. Diese bahnbrechenden Studien zeigten, dass die Mikroinjektion von Keimzellen von Mäusen fruchtbaren Spender in die Samenleiter des unfruchtbaren Empfängermäuse Ergebnisse in Donor abgeleitete Spermatogenese und Spermien durch den Empfänger Tier ^2. Die Nutzung von Spender männlichen Trägern die bakterielle β-Galactosidase-Gen erlaubte die Identifizierung Donor abgeleitete Spermatogenese und Übermittlung des Donor Haplotyp an die Nachkommen durch den Empfänger Tiere ^1. Überraschenderweise, nach der Transplantation in das Lumen der Tubuli seminiferi, waren transplantierten Keimzellen in der Lage, von der luminalen Kompartiment zu dem Basalmembran, wo Spermatogonien ³ angeordnet sind zu bewegen. Es ist allgemein anerkannt, dass nur SSCs der Lage, die Nische und wieder herzustellen Spermatogenese in den Hoden zu kolonisieren Empfänger sind. Daher KeimzelleTransplantation bietet einen funktionalen Ansatz, um die Stammzell-Nische in den Hoden zu studieren und zu vermeintlichen Stammsamenzellen charakterisieren. Bis heute ist Keimzelle Transplantation verwendet werden, um grundlegende Stammzellbiologie aufzuklären, um transgene Tiere durch genetische Manipulation der Keimzellen vor der Transplantation ^4,5 zu produzieren, zu Sertoli-Zell-Interaktion Keimzelle ^6,7, SSC Homing und Kolonisierung ^{3-Studie 8,} sowie SSC Selbsterneuerung und Differenzierung ^9,10.

Germ-Transplantation ist auch in großen Spezies ¹¹ machbar. In diesen sind die Hauptanwendungen Erhaltung der Fruchtbarkeit, die Verbreitung von Elite Genetik in Tierpopulationen, und die Erzeugung von transgenen Tieren, wie die Studie der Spermatogenese und SSC Biologie mit dieser Technik ist, logistisch schwieriger und teurer als bei Nagern. Die Transplantation von Keimzellen aus großen Arten in die Samenleiter von Mäusen führt zu colonization von Spenderzellen und Spermatogonien Expansion, aber nicht in ihrer vollen Differenzierung vermutlich aufgrund der Inkompatibilität des Empfängers somatische Zell-Kompartiment mit den Keimzellen von phylogenetisch entfernten Spezies ^12. Ein alternativer Ansatz ist die Transplantation von Keimzellen aus großen Arten zusammen mit den sie umgebenden somatischen Fach. Zunächst berichtete im Jahr 2002, dass kleine Fragmente von Hodengewebe aus unreifen Männchen unter die Rückenhaut von immundefizienten Mäusen transplantiert in der Lage, zu überleben und zu unterziehen volle Entwicklung mit der Produktion von Spermien Befruchtung zuständig sind ^13. Seitdem Hodengewebe Xenografting hat sich gezeigt, dass bei vielen Arten erfolgreich und entpuppte sich als wertvolle Alternative zu Hodenentwicklung und Spermatogenese der großen Tiere bei Mäusen ¹⁴ zu studieren.

Protocol

TEIL A. Germ-Transplantation bei Mäusen 1. Herstellung von Empfängermäuse Die Empfänger sollten immunologisch tolerant (entweder genetisch an die Spender oder immundefizienten abgestimmt) an die Spender Hoden-Zellen. Die Empfänger sollten entweder von Natur aus frei von Spermatogenese (zB W / W v Mäuse) oder abgereichertes endogener Keimzellen. Germ Zell-Depletion kann durch Bestrahlung oder Chemotherapeutika wie Busulfan erreicht werden. In diese…

Discussion

1. Germ-Transplantation

Keimzell-Transplantation bietet die einzig funktionierende Assay für eindeutige Bestätigung der Gegenwart von spermatogonialen Stammzellen (SSC) in einer Zellpopulation. Nur SSCs können nach Hause zu besiedeln und die SSC-Nische an der Basalmembran und initiieren Donor-derived Spermatogenese. Keimzelle der Transplantation war es möglich, zu studieren und zu manipulieren SSCs in beispielloser Weise. Die Technik wurde genutzt, um transgene Tiere durch genetische Manip…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Collagenase (type IV)	Sigma	C5138
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056
DNaseI	Sigma	DN25
DMEM	Invitrogen	31053-028
Trypan blue stain	Invitrogen	15250-061
Nylon mesh cell strainer	BD biosciences	352340 (40μm) 352350 (70μm)
Busulfan	Sigma	B2635
Thin-Wall Glass Capillaries	World Precision Instrument	TW 100-3
BD intramedic plyethylene tubing (PE100)	BD	CA-63018-725
Ethicon 6-0 Silk Suture	Ethicon	706G
Wound clips	BD	427631
Sigmacote	Sigma	SL2
X-gal	Sigma	B4252
Potassium Ferrocyanide	Sigma	P9387
Potassium Ferricyanide	Sigma	P3667
magnesium chloride	Sigma	208337
sodium deoxycholate	Sigma	D6750
N,N-Dimethylformamide	Sigma	D4551
Igepal CA-630	Sigma	18896