Het induceren van dendritische groei in gekweekte sympathische neuronen
Summary
We beschrijven een protocol voor het gebruik van botmorfogenetische eiwit-7 (BMP-7) of Matrigel om selectief te induceren dendritische groei van de primaire sympathische neuronen los worden gezien van de superieure cervicale ganglia (SCG) van perinatale ratten.
Abstract
De vorm van de dendritische spil bepaalt de totale synaptische ingang een neuron kan ontvangen 1-3, beïnvloedt de samenstelling en verdeling van deze ingangen 4-6. Veranderde patronen van dendritische groei en plasticiteit worden geassocieerd met een verminderde neuro-functie in experimentele modellen 7 en worden verondersteld bij te dragen aan de klinische symptomen waargenomen bij zowel neurologische stoornissen 8-10 en neurodegeneratieve ziekten 11-13. Dergelijke waarnemingen onderstrepen het functionele belang van precies regelen dendritische morfologie, en suggereren dat het identificeren van mechanismen die dendritische groei te beheersen niet alleen inzicht in hoe neuronale connectiviteit wordt geregeld tijdens de normale ontwikkeling te bevorderen, maar kan ook inzicht te geven op nieuwe therapeutische strategieën voor diverse neurologische aandoeningen.
Mechanistische studies van dendritische groei zou aanzienlijk worden vergemakkelijkt door de beschikbaarheid ofa model systeem waarmee neuronen om proefondervindelijk te worden omgeschakeld van een toestand waarin ze niet dendrieten uit te breiden tot een waarin ze een dendritische prieel vergelijkbaar met die van hun in vivo tegenhangers uit te werken. Primaire culturen van sympathische neuronen los worden gezien van de superieure cervicale ganglia (SCG) van perinatale knaagdieren voorziet in een dergelijk model. Wanneer gekweekt in beschreven medium in de afwezigheid van serum en ganglion gliacellen, sympathiek neuronen uit te breiden een proces dat is axonale, en dit unipolaire toestand aanhoudt weken tot maanden in de cultuur 14,15. De toevoeging van een bot morfogenetische proteïnen 7 (BMP-7) 16,17 of Matrigel 18 het kweekmedium activeert deze neuronen te verlengen meerdere processen dat de morfologische, biochemische en functionele criteria voor dendrieten. Sympathische neuronen los van de SCG van perinatale knaagdieren en geteeld onder bepaalde voorwaarden zijn van een homogene populatie van neuronen 19die op uniforme wijze reageren op de dendriet-bevorderend activiteit van Matrigel, BMP-7 en andere BMP's van de decapentaplegic (DPP) en 60A subfamilies 17,18,20,21. Belangrijk Matrigel en BMP-geïnduceerde vorming dendrietmorfologie treedt in de afwezigheid van veranderingen in celoverleving of axonale groei 17,18.
Hier beschrijven we hoe je los culturen van sympathische neuronen afgeleid van de SCG van perinatale ratten, zodat ze kunnen inspelen op de selectieve dendriet-bevorderend activiteit van Matrigel of BMP.
Protocol
Discussion
De voordelen van dit model omvatten: (a) de culturen uit een homogene populatie van sympathische neuronen zonder andere celtypen 17,23, (b) de groeifactor eisen van sympathische neuronen gevestigde, waardoor het gebruik van beschreven medium, en een verscheidenheid aan bepaalde media, en substraten werken goed voor het kweken en onderhouden van sympathische neuronen 23; (c) neuronen in deze culturen uniform te reageren op de dendriet-bevorderend activiteit van Matrigel, BMP-7 en andere BMP's va…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de financiering van de National Institutes of Health (subsidies R21 NS45037 en R01 ES014901).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Glass coverslips | Bellco | 1943-10012 | 12 mm Round Coverslip #1 Thickness, German glass |
| Bent tip pipets | Bellco | 1273-50003 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P0899-100MG | Stock solution 1 mg/ml |
| Distilled water | Gibco | 15230 | |
| Fine forceps Dumont no. 4 and 5 | Fine Science Tools (FST) | 11252-30 11241-30 | |
| 20-gauge needles | Becton Dickinson | 305176 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Invitrogen | 11415 | |
| Collagenase | Worthington | 4176 | 1 mg/ml |
| Dispase | Roche | 04942078001 | 5 mg/ml |
| Hank’s balanced salt solution( -Ca,-Mg) | Invitrogen | 14185-052 | |
| DMEM Low glucose | Invitrogen | 11885 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 20 mM |
| Insulin/Transferrin/ Selenium | Invitrogen | 51500-056 | 100X |
| Fatty-acid free BSA | Calbiochem | 126609 | |
| NGF | Harlan Bioproducts | 5017 | |
| Ham F-12 nutrient medium (F-12) | Invitrogen | 11765 | |
| Cytosine arabinoside | Sigma | C1768 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | Avoid repeated freeze-thaw cycles |
| BMP-7 | R&D Systems Curis, Inc. | 345-BP BMP7-07H | BMPs 4, 5 and 6 work equally as well as BMP-7 and are sometimes easier to obtain commercially |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Mouse anti-rat MAP2 antibody | Sternberg Monoclonals Inc. | SMI52 | 1/5000 |
| Alexa Fluor 546 goat-anti-mouse | Invitrogen | A11003 | 1/10000 |
| Mounting media | Prolong Antifade kit Molecular Probes | P7481 |
Table 1. Materials.
References
- Purpura, D. P., Quarton, Q. C., Melnechuk, T., Schmitt, F. O. . The Neurosciences: A Study Program. , 372-393 (1967).
- Purves, D. Functional and structural changes in mammalian sympathetic neurons following interruption of their axons. J. Physiol. 252, 429-463 (1975).
- Purves, D. . A Trophic Theory of Neural Connections. , (1988).
- Miller, J. P., Jacobs, G. A. Relationships between neuronal structure and function. J. Exp. Biol. 112, 129-145 (1984).
- Schuman, E. M. Synapse specificity and long-term information storage. Neuron. 18, 339-342 (1997).
- Sejnowski, T. J. The year of the dendrite. Science. 275, 178-179 (1997).
- Berger-Sweeney, J., Hohmann, C. F. Behavioral consequences of abnormal cortical development: insights into developmental disabilities. Behav. Brain Res. 86, 121-142 (1997).
- Connors, S. L. Fetal mechanisms in neurodevelopmental disorders. Pediatric Neurology. 38, 163-176 (2008).
- Pardo, C. A., Eberhart, C. G. The neurobiology of autism. Brain Pathology (Zurich, Switzerland). 17, 434-447 (2007).
- Zoghbi, H. Y. Postnatal neurodevelopmental disorders: meeting at the synapse. Science. 302, 826-830 (2003).
- de Ruiter, J. P., Uylings, H. B. Morphometric and dendritic analysis of fascia dentata granule cells in human aging and senile dementia. Brain Res. 402, 217-229 (1987).
- Flood, D. G., Coleman, P. D. Hippocampal plasticity in normal aging and decreased plasticity in Alzheimer’s disease. Prog. Brain Res. 83, 435-443 (1990).
- Jagadha, V., Becker, L. E. Dendritic pathology: an overview of Golgi studies in man. Can. J. Neurol. Sci. 16, 41-50 (1989).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. I. Conditions under which neurons form axons but not dendrites. Dev. Biol. 128, 324-336 (1988).
- Tropea, M., Johnson, M. I., Higgins, D. Glial cells promote dendritic development in rat sympathetic neurons in vitro. Glia. 1, 380-392 (1988).
- Lein, P. The effects of extracellular matrix and osteogenic protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. Int. J. Dev. Neurosci. 14, 203-215 (1996).
- Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15, 597-605 (1995).
- Lein, P. J., Higgins, D. Laminin and a basement membrane extract have different effects on axonal and dendritic outgrowth from embryonic rat sympathetic neurons in vitro. 136, 330-345 (1989).
- Higgins, D., Lein, P. J., Osterhout, D. J., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , 177-295 (1991).
- Beck, H. N., Drahushuk, K., Jacoby, D. B., Higgins, D., Lein, P. J. Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons. BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).
- Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).
- Lein, P. J. Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists. J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).
- Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth. Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).
