Nous décrivons un protocole pour l'utilisation de protéines morphogénétiques osseuses-7 (BMP-7) ou Matrigel pour induire sélectivement la croissance dendritique dans les neurones sympathiques dissociés primaires des ganglions cervicaux supérieurs (SCG) de rats périnatales.
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Article de méthode
Induire la croissance dendritique dans des cultures de neurones sympathiques
Dans cet article
Résumé
Résumé
La forme de la dendritique arbre détermine l'apport total synaptique d'un neurone peut recevoir 1-3, et influe sur les types et la distribution de ces intrants 4-6. Modification des modes de croissance dendritique et la plasticité sont associés à la fonction neurocomportementale avec facultés affaiblies dans les modèles expérimentaux 7, et sont pensés pour contribuer à des symptômes cliniques observés dans les deux troubles neurodéveloppementaux 8-10 et les maladies neurodégénératives 11-13. Ces observations soulignent l'importance fonctionnelle de la régulation précisément la morphologie dendritique, et suggèrent que l'identification des mécanismes qui contrôlent la croissance dendritique ne sera pas seulement faire progresser la compréhension de la façon dont la connectivité neuronale est régulée au cours du développement normal, mais peut également donner un aperçu sur les nouvelles stratégies thérapeutiques pour diverses maladies neurologiques.
Des études mécanistiques de la croissance dendritique serait grandement facilitée par la disponibilité osystème modèle FA qui permet aux neurones à titre expérimental est passé d'un état dans lequel ils ne s'étendent pas aux dendrites celui dans lequel ils élaborent un arbre dendritique comparable à celle de leur homologues dans les in vivo. Les cultures primaires de neurones sympathiques dissociés de ganglions cervicaux supérieurs (SCG) de rongeurs périnatales fournir un tel modèle. Lorsqu'elle est cultivée dans un milieu défini en l'absence de sérum et les cellules gliales ganglionnaire, les neurones sympathiques d'étendre un processus unique qui est axonale, et cet état persiste pendant unipolaire semaines à plusieurs mois dans la culture 14,15. Cependant, l'ajout de protéines soit morphogénétique osseuse-7 (BMP-7) 16,17 ou 18 à Matrigel le milieu de culture déclenche ces neurones d'étendre les processus multiples qui répondent aux critères morphologiques, biochimiques et fonctionnelles pour les dendrites. Neurones sympathiques dissociés de la CTB de rongeurs périnatales et cultivés dans des conditions définies sont une population homogène de neurones 19qui répondent de manière uniforme à l'activité dendrite-promotion de Matrigel, BMP-7 et autres PGB de la decapentaplegic (DPP) et 60A sous-familles 17,18,20,21. Important, le Matrigel-et BMP-induite dendrite formation se produit en l'absence de changements de la survie des cellules ou la croissance des axones 17,18.
Ici, nous décrivons comment mettre en place des cultures dissociées de neurones sympathiques provenant de la CTB de rats périnatales afin qu'ils soient adaptés à l'sélective dendrite-promotion de l'activité de Matrigel ou MPG.
Protocole
1. Préparation du milieu de culture (milieu C2)
- Ajoutez les lignes suivantes, dans l'ordre indiqué, à un stérile, flacon de 500 ml à usage unique Erlenmeyer:
Montant Composant Concentration finale 190 ml DMEM (faible taux de glucose) N / A 10 ml acides gras libres BSA (20mg/ml dans du DMEM) 50 pg / ml 2,8 ml L-glutamine 1,4 mM 4 ml l'insuline / transferrine / sélénium (100x) 10 pg / ml d'....
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Discussion
Les avantages de ce modèle comprennent: (a) les cultures sont composées d'une population homogène de neurones sympathiques dépourvus d'autres types cellulaires 17,23; (b) les exigences du facteur de croissance des neurones sympathiques sont bien établies, ce qui permet l'utilisation de milieu défini, et une variété de milieux définis, et les substrats fonctionnent bien pour la croissance et le maintien de neurones sympathiques 23; (c) les neurones dans ces cultures de répondre uniformém.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le financement de la National Institutes of Health (subventions R21 et R01 NS45037 ES014901).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
| Lamelles de verre | Bellco | 1943-10012 | 12 mm lamelle ronde n ° 1 Epaisseur de verre allemand |
| Bent pipettes pointe | Bellco | 1273-50003 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P0899-100MG | Solution stock 1 mg / ml |
| L'eau distillée | Gibco | 15230 | |
| Beaux-pince Dumont ne. 4 et 5 | Outils belle science (FST) | 11252-30 11241-30 | |
| 20 aiguilles de calibre | Becton Dickinson | 305176 | |
| Leibovitz milieu L-15 | Invitrogen | 11415 | |
| Collagenase | Worthington | 4176 | 1 mg / ml |
| Dispase | Roche | 04942078001 | 5 mg / ml |
| Hank solution de sel équilibrée (Ca-,-Mg) | Invitrogen | 14185-052 | |
| DMEM faible taux de glucose | Invitrogen | 11885 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030 | 20 mM |
| L'insuline / transferrine / Selenium | Invitrogen | 51500-056 | 100X |
| Des acides gras libres BSA | Calbiochem | 126609 | |
| NGF | Bioproduits Harlan | 5017 | |
| Jambon support F-12 nutriment (F-12) | Invitrogen | 11765 | |
| Cytosine arabinoside | Sigma | C1768 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | Éviter la répétition des cycles gel-dégel |
| BMP-7 | R & D Systems Curis, Inc | 345-BP-07H BMP7 | PGO 4, 5 et 6 de travailler tout aussi bien que la BMP-7 et sont parfois plus faciles à obtenir dans le commerce |
| Paraformaldéhyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Pêcheur | BP151-500 | |
| Souris anti-rat MAP2 anticorps | Sternberg monoclonaux Inc | SMI52 | 1/5000 |
| Alexa Fluor 546 de chèvre anti-souris | Invitrogen | A11003 | 1/10000 |
| Milieu de montage | Prolongez sondes moléculaires kit Antifade | P7481 |
Références
- Purpura, D. P. The Neurosciences: A Study Program. Quarton, Q. C., Melnechuk, T., Schmitt, F. O. , Rockefeller University Press. 372-393 (1967).
- Purves, D. Functional and structural changes in mammalian sympathetic neurons following interruption of their axons. J. Physiol. 252....
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Réimpressions et autorisations
