Induktion von dendritischen Wachstums in Cultured sympathischen Neuronen
Summary
Wir beschreiben ein Protokoll für die Verwendung Knochenmorphogenetischem Protein-7 (BMP-7) oder Matrigel, um selektiv zu induzieren dendritisches Wachstum in Original-sympathischen Neuronen dissoziiert von der oberen Halsganglien (SCG) der perinatalen Ratten.
Abstract
Die Form der dendritischen Dorn bestimmt die gesamte synaptischen Eingang ein Neuron erhält 1-3 können, und beeinflusst die Art und Verteilung dieser Eingänge 4-6. Veränderte Muster des dendritischen Wachstums und Plastizität sind mit beeinträchtigter Funktion neurobehavioral in experimentellen Modellen 7 zugeordnet und werden gedacht, um zu klinischen Symptomen in beiden neurologische Entwicklungsstörungen 8-10 und 11-13 neurodegenerativen Erkrankungen beobachtet beitragen. Solche Beobachtungen unterstreichen die funktionelle Bedeutung der exakt regulieren dendritische Morphologie, und legen nahe, dass Identifizierung von Mechanismen, dendritische Wachstum steuern nicht nur das Verständnis für, wie neuronale Konnektivität wird während der normalen Entwicklung geregelt, kann aber auch einen Einblick auf neue therapeutische Strategien für die verschiedensten neurologischen Erkrankungen.
Mechanistische Untersuchungen von dendritischen Wachstum würde durch die Verfügbarkeit o erleichtert werdenfa-Modell, das Neuronen experimentell aus einem Zustand, in dem sie nicht zu einer Verlängerung Dendriten auf, in dem sie einen dendritischen Dorn vergleichbar mit der von ihren Pendants in vivo erarbeiten geschaltet werden können. Primäre Kulturen von sympathischen Neuronen losgelöst von der überlegenen zervikalen Ganglien (SCG) der perinatalen Nager bieten ein solches Modell. Wenn in einem definierten Medium in Abwesenheit von Serum-und Ganglien-Glia-Zellen kultiviert werden, zu erweitern sympathischen Neuronen einen einzigen Vorgang, der axonalen ist, und dieser Zustand hält für unipolare Wochen bis Monate in Kultur 14,15. Jedoch löst die Zugabe von entweder Knochenmorphogenetischem Protein-7 (BMP-7) oder 16,17 Matrigel 18 mit dem Kulturmedium diese Neuronen, mehrere Prozesse, die die morphologische, biochemische und funktionelle Kriterien für Dendriten erstrecken. Sympathischen Neuronen losgelöst von der SCG der perinatalen Nagetiere und unter definierten Bedingungen gewachsen sind eine homogene Population von Neuronen 19, die gleichmäßig auf die Dendriten-Aktivität von Matrigel, BMP-7 und anderen BMPs der decapentaplegisch (dpp) und 60A Unterfamilien 17,18,20,21 reagieren. Wichtig ist, tritt Matrigel-und BMP-induzierte Dendritbildung in der Abwesenheit von Änderungen der das Überleben der Zelle oder axonalen Wachstums 17,18.
Hier beschreiben wir, wie Sie dissoziierten Kulturen sympathischer Neurone aus dem SCG der perinatalen Ratten abgeleitet, so dass sie in Reaktion auf die selektive Dendriten-Aktivität von Matrigel oder BMPs sind.
Protocol
Discussion
Die Vorteile dieses Modells sind: (a) werden die Kulturen einer homogenen Population von sympathischen Neuronen frei von anderen Zelltypen 17,23 umfasst, (b) die Anforderungen der Wachstumsfaktor sympathischen Neuronen sind gut etabliert, das erlaubt die Verwendung von definiertes Medium, und eine Vielzahl von definierten Medien und Substrate eignen sich gut für das Wachstum und die Aufrechterhaltung sympathischen Neuronen 23; (c) Neuronen in diesen Kulturen gleichmäßig Reaktion auf die Dendrite…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde aus Mitteln des National Institutes of Health (Zuschüsse R21 R01 und NS45037 ES014901) unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Glass coverslips | Bellco | 1943-10012 | 12 mm Round Coverslip #1 Thickness, German glass |
| Bent tip pipets | Bellco | 1273-50003 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P0899-100MG | Stock solution 1 mg/ml |
| Distilled water | Gibco | 15230 | |
| Fine forceps Dumont no. 4 and 5 | Fine Science Tools (FST) | 11252-30 11241-30 | |
| 20-gauge needles | Becton Dickinson | 305176 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Invitrogen | 11415 | |
| Collagenase | Worthington | 4176 | 1 mg/ml |
| Dispase | Roche | 04942078001 | 5 mg/ml |
| Hank’s balanced salt solution( -Ca,-Mg) | Invitrogen | 14185-052 | |
| DMEM Low glucose | Invitrogen | 11885 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 20 mM |
| Insulin/Transferrin/ Selenium | Invitrogen | 51500-056 | 100X |
| Fatty-acid free BSA | Calbiochem | 126609 | |
| NGF | Harlan Bioproducts | 5017 | |
| Ham F-12 nutrient medium (F-12) | Invitrogen | 11765 | |
| Cytosine arabinoside | Sigma | C1768 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | Avoid repeated freeze-thaw cycles |
| BMP-7 | R&D Systems Curis, Inc. | 345-BP BMP7-07H | BMPs 4, 5 and 6 work equally as well as BMP-7 and are sometimes easier to obtain commercially |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Mouse anti-rat MAP2 antibody | Sternberg Monoclonals Inc. | SMI52 | 1/5000 |
| Alexa Fluor 546 goat-anti-mouse | Invitrogen | A11003 | 1/10000 |
| Mounting media | Prolong Antifade kit Molecular Probes | P7481 |
Table 1. Materials.
References
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