Den VisioTracker är ett automatiserat system för kvantitativ analys av visuella prestanda larver och små vuxna fiskar baserad på registrering av ögonrörelser. Den har full kontroll över visuella stimulans egenskaper och analys i realtid, vilket möjliggör hög kapacitet forskning inom områden som visuellt systemutveckling och funktion, farmakologi, neurala studier krets och sensomotoriska integrationen.
Utredningar det visuella systemet utveckling och funktion kräver kvantifierbara beteendemodeller av visuell prestanda som är lätta att framkalla, robust och enkel att hantera. En lämplig modell har hittats i optokinetic responsen (OKR), en reflexiv beteende i alla ryggradsdjur på grund av sin höga val värde. Den OKR innebär långsamma stimulus-följande rörelser ögonen varvat med snabba återställning saccades. Mätningen av detta beteende lätt utförs i zebrafisk larver på grund av sin tidiga och stabila debut (fullt utvecklad efter 96 timmar efter befruktning (HPF)), och som omfattas av den ingående kunskap om zebrafisk genetik, under årtionden en av de gynnade modellen organismer i detta område. Samtidigt analys av liknande mekanismer i vuxen fisk har blivit allt viktigare, särskilt för farmakologiska och toxikologiska tillämpningar.
Här beskriver vi VisioTracker, ett helautomatiskt med hög throughput-system för kvantitativ analys av visuella prestanda. Systemet är baserat på forskning som utförts i gruppen professor Stephan Neuhauss och ny utformning av TSE Systems. Den består av en immobiliserande anordning för små fiskar övervakas av en högkvalitativ videokamera utrustad med en högupplösande zoomobjektiv. Fisken behållaren omges av en trumma skärm, på vilken datorgenererade stimulusmönster kan projiceras. Ögonrörelser registreras och automatiskt analyseras av VisioTracker mjukvarupaket i realtid.
Dataanalys kan omedelbart erkännande av parametrar såsom långsam och snabb fas varaktighet, rörelse cykel frekvens, långsam fas vinst, synskärpa och kontrastkänslighet.
Typiska resultat kan till exempel snabb identifiering av visuella systemet mutanter som visar någon uppenbar förändring av vildtyp morfologi, eller fastställandet av kvantitativa effekter av farmakologisk eller giftiga och mutagenaagenter på visuella prestanda.
Betydelsen av OKR för studier av synfunktionen har erkänts i det vetenskapliga samfundet under en längre tid (påsk & Nicola 1996, 1997), och försök att verkligen kvantifiera paradigm har börjat långt över ett decennium sedan. Påsk och Nicola (1996) utvecklat ett system med motoriserad roterande randiga trummor, där videoinspelning av ögonrörelser analyserades manuellt. Detta system drabbats av bristen på immobilisering av fisk embryot, som ofta har krävt manuell ompositionering och kunde detektera spårning rörelser ögon endast med stor svårighet. Ett steg framåt att använda en video-projicerad randig trumma för att möjliggöra mer varierande genererade dator stimulans presentation (Roeser & Baier, 2003,. Rinner et al, 2005a).
Den mest manuella, ram-för-bildruta analys av videoinspelade inspelningar har visat sig vara extremt arbetskrävande, och i viss mån hindras av observatör bias (Beck et al.2004). Automatiserad analys i realtid föreslogs att tillåta användning av beteendemässiga återkopplingsmekanismer lärande (Major et al., 2004). Användningen av infraröd belysning och frekvensstyrda roterande stimuli har banat väg genom Beck et al. (2004). Emellertid beskrivna systemet finns endast har använts för larver, och analys genomfördes off-line. Vidare medger VisioTracker fullständig kontroll över stimuli, däribland att ändra stimulans under experimentet, varigenom större flexibilitet och spontan inflytande på förloppet av experimentet. Dessutom, övervann digitala stimulans skapas som används av VisioTracker problem nämnts tidigare med acceleration av inerta massan av en randig stimulans trumma (Beck et al., 2004).
Larver återhållsamhet med metylcellulosa inte signifikant stör ögonrörelser och inte har några långsiktiga effekter på zebrafisk välbefinnande. Fiskyngel har framgångsriktupprätthålls inbäddade i metylcellulosa under flera dagar, tills syretillförsel genom huden blir otillräcklig för efterfrågan med stigande ålder (Qian et al., 2005).
De vuxna fiskarna återhållande metod är lika lätt på djuret. Den korta tid försöket, tillsammans med möjligheten att snabbt byta ut försöksdjur för en annan en, bidrar ytterligare till den positiva djurskyddsaspekterna av systemet. Eftersom gälarna kontinuerligt spolas med vatten, är det lämpligt att spika vattnet med någon kemikalie val att studera dess effekt på ögonrörelser och visuell prestanda. Likaså en wash-out experiment kan tillsättas utan att man behöver hantera djuret mellan experimenten.
Pixel brus i videobilden minimerades genom utjämning algoritmer den egenutvecklade VisioTracker programvara som möjliggör mycket exakta mätningar av ögats position och vinkelhastighet. Vidare, för att underlätta en statistiskanalys programvara filtreras bort saccadic rörelser som uppstår vid fasta hastighet och inte bidrar till den experimentella uttalande. En utjämning av hastighet kurvor över 7 videobildrutor underlättas senare analys.
Den VisioTracker öppnar en ny dimension för många olika forskningsområden. Systemet och dess föregångare redan har använts med framgång för att kvantifiera visuella prestanda i zebrafisk larver, med parametrar som synskärpa, kontrast känslighet och lätta anpassning (Rinner et al., 2005a, Schonthaler et al., 2010), för funktionell analys av kon fotoreceptorer efter manipulation av medlemmarna i den visuella transduktion kaskad (t.ex. Rinner et al, 2005b, Renninger et al, 2011.)., eller analys av visuella defekter i mutant zebrafisk larver (t.ex. Schonthaler et al, 2005, 2008,. Bahadori et al., 2006). Samspelet av morfologiska och funktionella mognaden av det visuella systemethar studerats av OKR mätningar som visar att synskärpan huvudsakligen men inte helt begränsas av fotoreceptor avstånd i larvstadier (Haug et al., 2010).
Den VisioTracker passar lika bra att analysera visuell funktion i vuxen zebrafisk och andra liknande storlek fiskarter (Mueller och Neuhauss (2010), denna rapport).
Det är också tänkbart att använda systemet i forskningsområden som toxikologi och farmakologi där ämnen som skall undersökas kan läggas till vattenflödet kring de vuxna fiskarna gälarna. Dessutom möjliggör mångsidighet VisioTracker mer noggranna analyser av till exempel ontogenetics av synfunktionen, neurala kretsen funktion och utveckling, eller sensomotoriska kontroll (se recension i Huang & Neuhauss, 2008).
The authors have nothing to disclose.
KPM stöddes av EU FP7 (RETICIRC).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0387 |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 |
35 mm cell culture dish | Corning | 430165 |
Serum pipette | Greiner bio-one | 612 361 |
VisioTracker | TSE Systems | 302060 |