ووصف طريقة استخدام الحالة الصلبة nanopores لرصد الامتزاز غير محدد من البروتينات على سطح غير العضوية. الأسلوب يعمل على مبدأ مقاوم النبض ، مما يسمح للامتزاز أن يكون بحث في الوقت الحقيقي وعلى مستوى واحد جزيء. لأن عملية امتصاص البروتين وحيد هو أبعد ما يكون عن التوازن ، نقترح العمل صفائف متوازي من nanopores الاصطناعية ، وتمكين لتحديد كمي لمعدل أول رد فعل واضح ترتيب ثابت الامتزاز البروتين وكذلك وانجميور ثابت الامتزاز.
وقد استخدمت الحالة الصلبة nanopores لتنفيذ القياسات على مستوى واحد جزيء لدراسة هيكل المحلي ومرونة من الأحماض النووية 1-6 ، وتتكشف من البروتينات 7 ، وتقارب ملزم من يغاندس مختلفة 8. وذلك بربط هذه nanopores لأسلوب مقاوم النبض 12/09 ، يمكن القيام به مثل هذه القياسات في إطار مجموعة واسعة من الظروف ودون الحاجة لوضع العلامات 3. في أسلوب مقاوم ، النبض ، وقدم حلا الملح الأيونية على كلا الجانبين من nanopore. لذلك ، هي التي تحرك الأيونات من جانب واحد من غرفة الى أخرى محتملة عبر الغشاء قبل تطبيقها ، مما أدى إلى تيار ثابت. تقسيم لتحليلها في nanopore يؤدي إلى انحراف واضحة المعالم في هذا التيار ، والتي يمكن تحليلها لاستخلاص المعلومات جزيء واحد. باستخدام هذه التقنية ، يمكن رصد امتصاص البروتينات واحدة في الجدران nanopore في إطار مجموعة واسعة منالظروف 13. البروتين الامتزاز تزداد أهمية ، لأنه كما يتقلص الأجهزة ميكروفلويديك في حجمها ، والتفاعل بين هذه الأنظمة مع البروتينات واحد يصبح مصدرا للقلق. يصف هذا بروتوكول الفحص السريع للبروتين ملزمة لنيتريد الأفلام ، والتي يمكن بسهولة أن تمتد إلى غيرها من الأفلام رقيقة قابلة للحفر nanopore ، أو على الأسطح نيتريد functionalized. ويمكن استكشاف مجموعة متنوعة من البروتينات في إطار مجموعة واسعة من الحلول وتغيير طبيعة الظروف. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لاستكشاف المزيد من المشاكل الأساسية باستخدام nanopore الطيفي.
الامتزاز عفوية من البروتينات على السطوح الصلبة للدولة 27-29 أهمية أساسية في عدد من المجالات ، مثل تطبيقات biochip وتصميم فئة جديدة من المواد الحيوية هجينة وظيفية. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن البروتينات كثف إلى الحالة الصلبة السطوح لا تظهر التنقل الأفقي أو معدلات ?…
The authors have nothing to disclose.
فإن الكتاب أود أن أشكر جون Grazul (جامعة كورنيل) ، اندريه Marziali (جامعة كولومبيا البريطانية في فانكوفر) وفنسنت الطبرد – كوسا (جامعة أوتاوا) لنصائحهم. ويتم تمويل هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم الوطنية الأميركية (DMR – 0706517 و 1006332 DMR -) ، والمعاهد الوطنية للصحة (R01 – GM088403). تم تنفيذ حفر nanopore في مرفق المجهر الإلكتروني لمركز كورنيل للبحوث المواد (CCMR) بدعم من المؤسسة الوطنية للعلوم — علوم المواد والهندسة مراكز البحوث (MRSEC) برنامج (DMR 0520404). تم تنفيذ إعداد الأغشية نيتريد السيليكون في مرفق كورنيل النانومترية الحجم ، وعضوا في شبكة تقنية النانو البنية التحتية الوطنية ، وهو مدعوم من قبل مؤسسة العلوم الوطنية (المنح ECS – 0335765).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Tecnai F20 S/TEM | FEI | S/TEM requires acceleration voltage ≥200kV and field-emission source. | |
20 nm thick silicon nitride membrane window for TEM | SPI | 4163SN-BA | |
Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | ||
Axon Digidata 1440A | Molecular Devices | ||
pCLAMP 10 software | Molecular Devices | Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software | |
Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A300 | |
hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
silicone O-rings | McMaster-Carr | 003 S70 | Alternatively use PDMS |
silver wire | Sigma-Aldrich | 348759 | For electrodes |
SPC Technology, D sub contact, pin | Newark | 9K4978 | For electrodes |
potassium chloride | Sigma | P9541 | |
potassium phosphate dibasic | Sigma | P2222 | |
potassium phosphate monobasic | Sigma | P5379 | |
PDMS | Dow Corning | Sylgar 184 Elastomer set. For making chamber. | |
Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Fast acting silicone sealant |
hot plate | Fisher Scientific | ||
Faraday cage |