אנחנו צריכים לשנות את השמרים קונבנציונאלי שני היברידית ההקרנה, כלי גנטי יעיל בזיהוי אינטראקציה חלבון. שינוי זה ניכר מקצרת את התהליך, מפחית את עומס העבודה, והכי חשוב, מפחיתה את מספר תוצאות חיוביות שגויות. בנוסף, גישה זו היא לשחזור ואמין.
Progranulin (PGRN), הידוע גם בשם מבשר epithelin granulin (GEP), הוא גורם-593 חומצות אמיניות צמיחה autocrine. PGRN ידוע לשחק תפקיד קריטי במגוון של תהליכים פיזיולוגיים ומחלות, כולל העובר מוקדם, ריפוי פצעים 1, דלקת 2, 3, ו מארח הגנה 4. PGRN גם פונקציות כגורם neurotrophic 5, מוטציות בגן PGRN שגורם לאובדן חלקי של דמנציה לגרום חלבון PGRN frontotemporal 6, 7. מחקרים אחרונים שלנו הביאו לבידודה של PGRN כמו וסת חשוב של התפתחות סחוס השפלה 8-11. למרות PGRN, גילה כמעט לפני שני עשורים, משחק תפקידים מכריעים מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים מרובים, מאמץ לנצל את הפעולות של PGRN ולהבין את המנגנונים המעורבים כבר הקשו באופן משמעותי על ידי חוסר היכולת שלנו לזהות את הקולטן שלו מחייב (ים). כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו מודיfied שמרים שני היברידית (MY2H) המבוססת על המערכת הנפוצה ביותר GAL4 2-היברידית מבוססת. בהשוואה למסך רגיל שמרים שני היברידית, MY2H דרמטי מקצרת את תהליך המסך מפחית את מספר שיבוטים חיובי כוזב. בנוסף, גישה זו היא לשחזור אמין, ויש לנו בהצלחה המועסקים במערכת זו לבודד את החלבונים המחייב של פיתיונות שונים, כולל יון ערוץ 12, תאי חלבון מטריקס 10, 13, 14 ו – גורם גדילה. במאמר זה, אנו מתארים את הליך הניסוי MY2H בפירוט באמצעות PGRN כדוגמה שהוביל לזיהוי TNFR2 כמו הקולטן first PGRN הקשורים ידוע 14, 15.
שני היברידית ההקרנה שמרים הוכיחה להיות כלי יעיל בזיהוי אינטראקציה חלבון 16, 17. לעומת גישות אחרות לזיהוי חלבונים מחייב שותפים, כגון שיתוף טיהור חלבון שבבי ביוכימיים, שמרים שני מערכת היברידית היא גישה גנטי רגיש, שניתן להשתמש בהם להקרנה מספרים גבוהים מאוד של קידוד …
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי מענקי מחקר NIH K01AR053210, R01AR061484 ו מענק מהקרן הלאומית פסוריאזיס.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
ProQuest two-hybrid system | Invitrogen | 10835 |
YPD Growth Medium | Clontech | 630409 |
YPD Agar Medium | Clontech | 630410 |
Minimal SD agar Base | Clontech | 630412 |
-Leu DO Supplement | Clontech | 630414 |
-Leu/-Trp DO Supplement | Clontech | 630417 |
-His/-Leu/-Trp/-Ura DO Supplement | Clontech | 630425 |
3-Amino-1,2,4-Triazole (3AT) | Sigma-Aldrich | A8056 |
Luria broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3022 |
X-Gal | Invitrogen | 15520-034 |
Sonicated Salmon Sperm DNA | Stratagene | 201190 |
Ampicillin | AMRESCO | 0339 |
Kanamycin Sulfate | Invitrogen | 11815-024 |
Subcloning Efficiency™ DH5α™ Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 |
Trizma® base | Sigma-Aldrich | T6066 |
Lithium acetate | Sigma-Aldrich | L4158 |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED |
Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 |
10-cm petri dish | ITI Scientific | CT-903 |
Incubator (30 °C) | ATR (Ecotron) |