השתנה שמרים-Two-Hybrid System כדי לזהות חלבונים אינטראקציה עם גורם הגדילה Progranulin
Summary
אנחנו צריכים לשנות את השמרים קונבנציונאלי שני היברידית ההקרנה, כלי גנטי יעיל בזיהוי אינטראקציה חלבון. שינוי זה ניכר מקצרת את התהליך, מפחית את עומס העבודה, והכי חשוב, מפחיתה את מספר תוצאות חיוביות שגויות. בנוסף, גישה זו היא לשחזור ואמין.
Abstract
Progranulin (PGRN), הידוע גם בשם מבשר epithelin granulin (GEP), הוא גורם-593 חומצות אמיניות צמיחה autocrine. PGRN ידוע לשחק תפקיד קריטי במגוון של תהליכים פיזיולוגיים ומחלות, כולל העובר מוקדם, ריפוי פצעים 1, דלקת 2, 3, ו מארח הגנה 4. PGRN גם פונקציות כגורם neurotrophic 5, מוטציות בגן PGRN שגורם לאובדן חלקי של דמנציה לגרום חלבון PGRN frontotemporal 6, 7. מחקרים אחרונים שלנו הביאו לבידודה של PGRN כמו וסת חשוב של התפתחות סחוס השפלה 8-11. למרות PGRN, גילה כמעט לפני שני עשורים, משחק תפקידים מכריעים מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים מרובים, מאמץ לנצל את הפעולות של PGRN ולהבין את המנגנונים המעורבים כבר הקשו באופן משמעותי על ידי חוסר היכולת שלנו לזהות את הקולטן שלו מחייב (ים). כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו מודיfied שמרים שני היברידית (MY2H) המבוססת על המערכת הנפוצה ביותר GAL4 2-היברידית מבוססת. בהשוואה למסך רגיל שמרים שני היברידית, MY2H דרמטי מקצרת את תהליך המסך מפחית את מספר שיבוטים חיובי כוזב. בנוסף, גישה זו היא לשחזור אמין, ויש לנו בהצלחה המועסקים במערכת זו לבודד את החלבונים המחייב של פיתיונות שונים, כולל יון ערוץ 12, תאי חלבון מטריקס 10, 13, 14 ו – גורם גדילה. במאמר זה, אנו מתארים את הליך הניסוי MY2H בפירוט באמצעות PGRN כדוגמה שהוביל לזיהוי TNFR2 כמו הקולטן first PGRN הקשורים ידוע 14, 15.
Protocol
Discussion
שני היברידית ההקרנה שמרים הוכיחה להיות כלי יעיל בזיהוי אינטראקציה חלבון 16, 17. לעומת גישות אחרות לזיהוי חלבונים מחייב שותפים, כגון שיתוף טיהור חלבון שבבי ביוכימיים, שמרים שני מערכת היברידית היא גישה גנטי רגיש, שניתן להשתמש בהם להקרנה מספרים גבוהים מאוד של קידוד …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי מענקי מחקר NIH K01AR053210, R01AR061484 ו מענק מהקרן הלאומית פסוריאזיס.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| ProQuest two-hybrid system | Invitrogen | 10835 |
| YPD Growth Medium | Clontech | 630409 |
| YPD Agar Medium | Clontech | 630410 |
| Minimal SD agar Base | Clontech | 630412 |
| -Leu DO Supplement | Clontech | 630414 |
| -Leu/-Trp DO Supplement | Clontech | 630417 |
| -His/-Leu/-Trp/-Ura DO Supplement | Clontech | 630425 |
| 3-Amino-1,2,4-Triazole (3AT) | Sigma-Aldrich | A8056 |
| Luria broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3022 |
| X-Gal | Invitrogen | 15520-034 |
| Sonicated Salmon Sperm DNA | Stratagene | 201190 |
| Ampicillin | AMRESCO | 0339 |
| Kanamycin Sulfate | Invitrogen | 11815-024 |
| Subcloning Efficiency™ DH5α™ Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 |
| Trizma® base | Sigma-Aldrich | T6066 |
| Lithium acetate | Sigma-Aldrich | L4158 |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED |
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 |
| 10-cm petri dish | ITI Scientific | CT-903 |
| Incubator (30 °C) | ATR (Ecotron) |
References
- He, Z. Progranulin is a mediator of the wound response. Nat. Med. 9, 225-229 (2003).
- Kessenbrock, K. Proteinase 3 and neutrophil elastase enhance inflammation in mice by inactivating antiinflammatory progranulin. J. Clin. Invest. 118, 2438-2447 (2008).
- Zhu, J. Conversion of proepithelin to epithelins: roles of SLPI and elastase in host defense and wound repair. Cell. 111, 867-878 (2002).
- Yin, F. Exaggerated inflammation, impaired host defense, and neuropathology in progranulin-deficient mice. J. Exp. Med. 207, 117-128 (2010).
- Van Damme, P. Progranulin functions as a neurotrophic factor to regulate neurite outgrowth and enhance neuronal survival. J. Cell. Biol. 181, 37-41 (2008).
- Baker, M. Mutations in progranulin cause tau-negative frontotemporal dementia linked to chromosome 17. Nature. 442, 916-919 (2006).
- Cruts, M. Null mutations in progranulin cause ubiquitin-positive frontotemporal dementia linked to chromosome 17q21. Nature. 442, 920-924 (2006).
- Guo, F. Granulin-epithelin precursor binds directly to ADAMTS-7 and ADAMTS-12 and inhibits their degradation of cartilage oligomeric matrix protein. Arthritis Rheum. 62, 2023-2036 (2010).
- Feng, J. Q. Granulin epithelin precursor: a bone morphogenic protein 2-inducible growth factor that activates Erk1/2 signaling and JunB transcription factor in chondrogenesis. FASEB. J. 24, 1879-1892 (2010).
- Xu, K. Cartilage oligomeric matrix protein associates with granulin-epithelin precursor (GEP) and potentiates GEP-stimulated chondrocyte proliferation. J. Biol. Chem. 282, 11347-11355 (2007).
- Liu, C. J. The role of ADAMTS-7 and ADAMTS-12 in the pathogenesis of arthritis. Nat. Clin. Pract. Rheumatol. 5, 38-45 (2009).
- Liu, C., Dib-Hajj, S. D., Waxman, S. G. Waxman, S.G. Fibroblast growth factor homologous factor 1B binds to the C terminus of the tetrodotoxin-resistant sodium channel rNav1.9a (NaN). J. Biol. Chem. 276, 18925-18933 (2001).
- Liu, C. J. ADAMTS-7: a metalloproteinase that directly binds to and degrades cartilage oligomeric matrix protein. FASEB. J. 20, 988-990 (2006).
- Tang, W. The Growth Factor Progranulin Binds to TNF Receptors and Is Therapeutic Against Inflammatory Arthritis in Mice. Science. 332, 478-484 (2011).
- Wu, H., Siegel, R. M. Progranulin Resolves Inflammation. Science. 332, 427-428 (2011).
- Hollenberg, S. M. Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Mol. Cell. Biol. 15, 3813-3822 (1995).
- Vojtek, A. B., Hollenberg, S. M., Cooper, J. A. Mammalian Ras interacts directly with the serine/threonine kinase Raf. Cell. 74, 205-214 (1993).
