성장 팩터 Progranulin와 상호 작용하는 단백질을 식별하기 위해 수정된 효모 - 2 하이브리드 시스템
Summary
우리는 기존의 누룩 두 하이브리드 심사, 단백질 상호 작용을 식별하는 효과적인 유전자 도구를 수정했습니다. 이 수정은 현저하게, 과정을 단축 부하를 감소하고, 가장 중요한, 잘못된 반응의 수를 줄일 수 있습니다. 또한,이 방법은 재현성과 신뢰성이다.
Abstract
또한 granulin epithelin 전구체 (GEP)로 알려진 Progranulin (PGRN)는, 593 – 아미노 산 autocrine 성장 요소입니다. PGRN 일찍 embryogenesis, 치유 1, 염증 2, 3 상처, 그리고 호스트 방위 사를 포함하여, physiologic 및 질병 프로세스의 다양한 중요한 역할을하는 것으로 알려져 있습니다. neurotrophic 요인 5, PGRN 단백질 원인 frontotemporal 치매 6, 7의 일부 손실 발생 PGRN 유전자의 돌연변이로 PGRN는 기능을 수행합니다. 최근 연구 연골 개발 및 열화 8-11의 중요한 조절기로 PGRN의 고립에 LED가있다. PGRN가 근 20 년 전에 발견하지만, 여러 생리 및 병리 학적 조건에 PGRN의 동작을 이용하여 관련된 메커니즘을 이해하기 위해 노력을 현저하게 그 구속력 수용체 (들)을 식별하기 위해 무능력에 의해 방해되었을에 중요한 역할을 담당합니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 modi을 개발얘기 들이었다 효모 두 하이브리드 (MY2H)은 가장 일반적으로 사용되는 GAL4 기반 2 – 하이브리드 시스템을 기반으로 접근. 종래의 효모 두 하이브리드 화면과 비교 MY2H 크게 화면 프로세스를 단축하고 거짓 긍정적인 클론의 수를 줄일 수 있습니다. 또한,이 방법은 재현성과 신뢰성이 있으며, 우리는 성공적으로 이온 채널 12, 세포외 기질 단백질 10, 13, 및 성장 인자 14 등 각종 baits의 바인딩 단백질을 분리하는이 시스템을 고용했습니다. 본 논문에서는, 우리는 최초로 알려진 PGRN – 관련 수용체 14, 15 TNFR2의 신분에 LED 예를 들어 PGRN를 사용하여 세부 사항이 MY2H 실험 절차를 설명합니다.
Protocol
Discussion
효모 두 하이브리드 심사는 단백질 상호 작용 16, 17 식별에 효과적인 도구로 증명되었습니다. 에, 같은 생화학 공동 정화 및 단백질 칩, 효모 두 하이브리드 시스템이 비교적 간단한 실험 순서를 코딩 매우 높은 숫자를 검사에 사용할 수있는 민감한 유전자 접근 방식이므로 단백질 바인딩 파트너를 식별하는 다른 접근과 비교 또한, 그것은 생체내 상호 작용의를 감지하고 복잡한 단백질 정…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH 연구 기금 K01AR053210, R01AR061484 및 국립 건선 재단의 교부금에 의해 투자되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| ProQuest two-hybrid system | Invitrogen | 10835 |
| YPD Growth Medium | Clontech | 630409 |
| YPD Agar Medium | Clontech | 630410 |
| Minimal SD agar Base | Clontech | 630412 |
| -Leu DO Supplement | Clontech | 630414 |
| -Leu/-Trp DO Supplement | Clontech | 630417 |
| -His/-Leu/-Trp/-Ura DO Supplement | Clontech | 630425 |
| 3-Amino-1,2,4-Triazole (3AT) | Sigma-Aldrich | A8056 |
| Luria broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3022 |
| X-Gal | Invitrogen | 15520-034 |
| Sonicated Salmon Sperm DNA | Stratagene | 201190 |
| Ampicillin | AMRESCO | 0339 |
| Kanamycin Sulfate | Invitrogen | 11815-024 |
| Subcloning Efficiency™ DH5α™ Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 |
| Trizma® base | Sigma-Aldrich | T6066 |
| Lithium acetate | Sigma-Aldrich | L4158 |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED |
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 |
| 10-cm petri dish | ITI Scientific | CT-903 |
| Incubator (30 °C) | ATR (Ecotron) |
References
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