Isolering av Dendritiska Mouse lungceller
Summary
Ett renat beredning av dendritiska mus lungceller beskrivs. Särskild vikt läggs vid isolering av konventionella dendritiska celler delmängd.
Abstract
Lung dendritiska celler (DC) spelar en grundläggande roll i avkänning invaderande patogener 1,2 samt kontroll av tolerogenic svar 3 i luftvägarna. Minst tre huvudsakliga grupper av celler lunga dendritiska har beskrivits i möss: konventionella DC (CDC) 4, plasmacytoid DC (PDC) 5 och IFN-producerande killer DC (IKDC) 6,7. CDC delmängd är den mest framträdande DC delmängd i lungan 8.
Den gemensamma markör kända för att identifiera DC delmängder är CD11c, en typ I transmembrant integrin (β2) som också uttrycks på monocyter, makrofager, neutrofiler och några B-celler 9. I vissa vävnader, med hjälp av CD11c som markör för att identifiera musen DC är giltiga, som i mjälte, där de flesta CD11c + celler representerar CDC delmängd som uttrycker höga nivåer av de stora histocompatibility komplex klass II (MHC-II). Men det är lungan en mer heterogen vävnad där varasidan DC delmängder finns det en hög andel av en distinkt cellpopulation som uttrycker höga nivåer av CD11c anfallen låga nivåer av MHC-II. Baserat på dess karakteristik och främst på dess uttryck F4/80, en mjälten makrofager markör har CD11c hi MHC-II-lo lung cellpopulation identifierats som lungmakrofager 10 och mer nyligen, som en potentiell DC föregångare 11.
I motsats till musen PDC, har studiet av den särskilda roll som CDC i pulmonell immunförsvaret varit begränsad på grund av brist på en specifik markör som kan hjälpa vid isolering av dessa celler. Därför, i detta arbete, beskriver vi ett förfarande för att isolera renat musen lung CDC. Isolering av pulmonell DC delmängder utgör ett mycket användbart verktyg för att få insikt i funktionen hos dessa celler som svar på respiratoriska patogener samt miljöfaktorer som kan utlösa värd immunsvar i lungan.
Protocol
Discussion
Isolering av pulmonell mus DC är en viktig teknik för att studera ett brett spektrum av respiratoriska stimuli. Processen för att erhålla dessa celler innehåller kritiska moment som förhindrar förlust av celler samt cellernas livskraft och renhet. Perfusing lungan innan samlingen kan bidra till att eliminera perifera celler samt minska föroreningar erytrocyter. Användningen av automatiserade dissociation kan advanteogus när ett stort antal lungorna hanteras, annars kan du välja den alternativa protokoll, med …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka till Marilyn Dietrich vid LSU flödescytometrisystem Core Facility för hennes hjälp med cellen sortering och Peter Mottram för hans hjälp med mikrofotografier. Detta arbete har finansierats av Flight Attendant Medical Research Institute, LSU-Competitive Research Program Award och NIH / NIAID Bidrag P20 RR020159 och R03AI081171.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| ACK lysing buffer | Invitrogen | D6-0005DG | |
| Anti-mouse CD11c (HL3) | BD Pharmingen | 5580979 | PE-Cy7 conjugated |
| Anti-mouse I-A/I-E (269) | BD-Pharmingen | 553623 | FITC conjugated |
| Collangenase Type 1A | Sigma | 9891-500MG | |
| Cell strainers | BD Falcon | 352340, 352360 | |
| CD11c (N418) Microbeads | Miltenyi | 130-052-001 | |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Hank’s Balanced Salt solution | Invitrogen | 14170 | |
| Hepes buffer solution | Invitrogen | 15630 | |
| Petri dishes 60 mm | BD Falcon | 351016 | |
| GentleMACS™ C tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Gentle MACS dissociator | Miltentyi | 130-093-235 | |
| AutoMACS-Pro™ | Miltenyi | 130-092-545 | |
| FASCS Aria | BD |
References
- Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. Sensing pathogens and tuning immune responses. Science. 293, 253-256 (2001).
- Banchereau, J. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
- Manicassamy, S., Pulendran, B. Dendritic cell control of tolerogenic responses. Immunol. Rev. 241, 206-227 (2011).
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J. Exp. Med. 137, 1142-1162 (1973).
- Asselin-Paturel, C. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2, 1144-1150 (2001).
- Chan, C. W. Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive immunity. Nat. Med. 12, 207-213 (2006).
- Taieb, J. A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance. Nat. Med. 12, 214-219 (2006).
- Guerrero-Plata, A., Kolli, D., Hong, C., Casola, A., Garofalo, R. P. Subversion of pulmonary dendritic cell function by paramyxovirus infections. Journal of Immunology. 182, 3072-3083 (2009).
- Larson, R. S., Springer, T. A. Structure and function of leukocyte integrins. Immunol. Rev. 114, 181-217 (1990).
- Sung, S. S. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J. Immunol. 176, 2161-2172 (2006).
- Wang, H. Local CD11c+ MHC class II- precursors generate lung dendritic cells during respiratory viral infection, but are depleted in the process. J. Immunol. 177, 2536-2542 (2006).
- Bhatia, S. Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance of alternatively activated phenotype. PLoS One. 6, e15943-e15943 (2011).
- Shao, Z., Makinde, T. O., McGee, H. S., Wang, X., Agrawal, D. K. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand regulates migratory pattern and antigen uptake of lung dendritic cell subsets in a murine model of allergic airway inflammation. J. Immunol. 183, 7531-75381 (2009).
- Hao, X., Kim, T. S., Braciale, T. J. Differential response of respiratory dendritic cell subsets to influenza virus infection. J. Virol. 82, 4908-4919 (2008).
