מדידת טרנסלוקציה פפטיד לתוך שלפוחית Unilamellar גדול
Summary
זה פרוטוקול פרטים שיטה למדידת כמותית של טרנסלוקציה הפפטיד לתוך שלפוחית גדולה השומנים unilamellar. שיטה זו מספקת גם מידע על שיעור של טרנסלוקציה בממברנה והוא יכול לשמש כדי לזהות את הפפטידים זה ביעילות באופן ספונטני לחצות bilayers השומנים.
Abstract
יש עניין פעיל פפטידים בקלות לחצות קרום התא ללא סיוע של קולטני קרום התא 1. רבים מהם מתייחסים כאל תא חודר פפטידים, אשר ציין לעיתים קרובות את הפוטנציאל שלהם בתור משלוח סמים וקטורים 1-3. יתר על כן, יש עניין גובר פפטידים מיקרוביאלית שפועלים דרך הממברנה ללא מנגנוני ממס 4,5, במיוחד אלו לחצות קרומים חיידקיים ללא גרימת תמוגה התא ולהרוג תאים על ידי הפרעה תהליכים תאיים 6,7. למעשה, החוקרים הצביעו יותר ויותר את הקשר בין פפטידים התא חודר מיקרוביאלית 1,8. הבנה של המשרד בתהליך של טרנסלוקציה קרום ואת הקשר בין מבנה הפפטיד ואת יכולתו translocate דורש יעילות, מבחני לשחזור עבור טרנסלוקציה. כמה קבוצות הציעו שיטות למדוד טרנסלוקציה לתוך unilamel גדולהשומנים שלפוחית lar ('לאב') 13/09. 'לאב' כמודלים שימושיים קרום התא של חיידקים האיקריוטים והם משמשים לעתים קרובות במחקרים פלורסנט פפטיד 14,15. כאן, אנו מתארים את היישום שלנו של השיטה שפותחה לראשונה על ידי Matsuzaki ועמיתים לעבודה לשקול פפטידים מיקרוביאלית, כגון magainin ו buforin II 16,17. בנוסף לאספקת פרוטוקול שלנו עבור שיטה זו, אנו גם מציגים גישה פשוטה לניתוח נתונים מכמת היכולת טרנסלוקציה באמצעות assay. היתרונות של assay זה טרנסלוקציה לעומת אחרים כי יש לו את הפוטנציאל לספק מידע על שיעור של טרנסלוקציה בממברנה ואינו דורש תוספת של תווית ניאון, אשר יכול לשנות תכונות פפטיד 18, אל טריפטופן המכיל פפטידים. בקיצור, היכולת טרנסלוקציה לתוך שלפוחית שומנים בדם נמדדת כפונקציה של העברת אנרגיה תהודה פוסטר (סריג) בין שאריות טריפטופן יליד דansyl phosphatidylethanolamine כאשר חלבונים הקשורים החיצוני LUV הקרום (איור 1). Cell-חודר פפטידים הם ביקע כפי שהם נתקלים טריפסין מעצורים במארז עם 'לאב', המוביל ההתנערות מן הקרום LUV ועל ירידה סריג האות. הירידה סריג האות שנצפה עבור פפטיד translocating הוא גדול משמעותית מזה שנצפה עבור פפטיד זהה כאשר 'לאב' מכילים הן טריפסין ו מעכב טריפסין, או כאשר פפטיד זה לא ספונטני לעבור ממברנות שומנים בדם נחשף טריפסין המכילים 'לאב'. שינוי זה מספק כימות הקרינה הישירה של טרנסלוקציה פפטיד לאורך זמן.
Protocol
Discussion
הפרוטוקול המובא כאן יכול לשמש כדי להעריך את השינוי היחסי בריכוז של פפטידים ומחוצה שלפוחית השומנים. שינויים אלה קשורים ליכולת טרנסלוקציה. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות תאים חודר פפטידים עם פוטנציאל כמו וקטורים משלוח סמים. כאשר הריבית בתא חודר פפטידים גדל, זה יהי…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות אלינור פלמינג ג'סיקה חן לדיונים מועילים. המימון ניתן על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIH-NIAID) פרס R15AI079685 לבין תאגיד מחקר קוטרל פרס קולג' למדע. תמיכה סטודנט נוסף סופק על ידי הווארד יוז רפואי במכון ואת קרן סטנלי.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 16:0-18:1 PG | Avanti Polar Lipids | 840457C |
| 1:18 Dansyl PE | Avanti Polar Lipids | 810330C |
| 16:0-18:1 PC | Avanti Polar Lipids | 850457C |
| Porcine trypsin | Sigma | T-0303 |
| Bowman-Birk trypsin/chymotrypsin inhibitor | Sigma | T-9777 |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 |
| Ammonium molybdate (para) | Alfa Aesar | 10811 |
| L-ascorbic acid | Sigma | A1417 |
| Hydrogen Peroxide, 30% solution | Mallinckrodt chemicals | 5240-05 |
| HEPES | Sigma | H-3375 |
| NaCl | Sigma | S-9625 |
| EDTA | Sigma | E5134 |
| NaH2PO4 | Sigma | S-0751 |
References
- Henriques, S. T., Melo, M. N., Castanho, M. A. Cell-penetrating peptides and antimicrobial peptides: how different are they?. Biochem. J. 399 (1), 1-1 (2006).
- Trehin, R., Merkle, H. P. Chances and pitfalls of cell penetrating peptides for cellular drug delivery. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 209-209 (2004).
- Temsamani, J., Vidal, P. The use of cell-penetrating peptides for drug delivery. Drug Discov. Today. 9 (23), 1012-1012 (2004).
- Hale, J. D., Hancock, R. E. Alternative mechanisms of action of cationic antimicrobial peptides on bacteria. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 5 (6), 951-951 (2007).
- Nicolas, P., Rosenstein, Y. Multifunctional host defense peptides. FEBS J. 276 (22), 6464-6464 (2009).
- Boman, H. G., Agerberth, B., Boman, A. Mechanisms of Action on Escherichia-Coli of Cecropin-P1 and Pr-39, 2 Antibacterial Peptides from Pig Intestine. Infection and Immunity. 61 (7), 2978-2978 (1993).
- Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of action of the antimicrobial peptide buforin II: Buforin II kills microorganisms by penetrating the cell membrane and inhibiting cellular functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 244 (1), 253-253 (1998).
- Bobone, S. The thin line between cell-penetrating and antimicrobial peptides: the case of Pep-1 and Pep-1-K. J. Pept. Sci. 17 (5), 335-335 (2011).
- Marks, J. R., Placone, J., Hristova, K., Wimley, W. C. Spontaneous Membrane-Translocating Peptides by Orthogonal High-throughput Screening. J. Am. Chem. Soc.. , (2011).
- Rosenbluh, J. Translocation of histone proteins across lipid bilayers and Mycoplasma membranes. J. Mol. Biol. 345 (2), 387-387 (2005).
- Bárány-Wallje, E. A critical reassessment of penetratin translocation across lipid membranes. Biophys. J. 89 (4), 2513-2513 (2005).
- Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. Translocation of beta-galactosidase mediated by the cell-penetrating peptide pep-1 into lipid vesicles and human HeLa cells is driven by membrane electrostatic potential. Biochimie. 44 (30), 10189-10189 (2005).
- Orioni, B. Membrane perturbation by the antimicrobial peptide PMAP-23: a fluorescence and molecular dynamics study. Biochim. Biophys. Acta. 1788 (7), 1523-1523 (2009).
- Ladokhin, A. S., Jayasinghe, S., White, S. H. How to measure and analyze tryptophan fluorescence in membranes properly, and why bother?. Anal. Biochem. 285 (2), 235-235 (2000).
- Epand, R. M., Epand, R. F. Liposomes as models for antimicrobial peptides. Methods Enzymol. 372, 124-124 (2003).
- Kobayashi, S. Interactions of the novel antimicrobial peptide buforin 2 with lipid bilayers: Proline as a translocation promoting factor. Biochimie. 39 (29), 8648-8648 (2000).
- Matsuzaki, K., Murase, O., Fujii, N., Miyajima, K. Translocation of a channel-forming antimicrobial peptide, magainin 2, across lipid bilayers by forming a pore. Biochimie. 34 (19), 6521-6521 (1995).
- Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. Re-evaluating the role of strongly charged sequences in amphipathic cell-penetrating peptides: a fluorescence study using Pep-1. FEBS Lett. 579 (20), 4498-4498 (2005).
- Torchilin, V. P., Weissig, V. . Liposomes. , (2003).
- Almeida, P. F., Pokorny, A. Avanti Polar Lipids, Determination of Total Phosphorus. Biochimie. 1686 (34), 8083-8083 (2009).
- Kobayashi, S. Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2. Biochimie. 43 (49), 15610-15610 (2004).
