대형 Unilamellar Vesicles로 펩타이드의 Translocation 측정
Summary
이 프로토콜 세부 대형 unilamellar 지질 vesicles로 펩타이드 translocation의 양적 측정을위한 방법입니다. 이 방법은 또한 멤브레인 translocation의 속도에 대한 정보를 제공하고 효율적이고 자발적 지질 bilayers를 건너되는 펩티드를 식별하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
쉽게 세포막 수용체 1의 도움없이 세포 세포막을 교차 펩티드에 적극적인 관심이 있습니다. 이들의 대부분은 자주 약물 전달 벡터 1-3으로 자신의 잠재력에 대해 설명되어 있습니다 세포 관통 펩티드,라고합니다. 또한, 특히 4,5 이외의 멤브레인 lytic 메커니즘, 세포 용해를 일으키는 않고 박테리아 세포막을 건너 세포내 프로세스 6,7을 방해하여 세포를 죽일 이들을 통해 작동 항균 펩티드의 증가 관심이 있습니다. 사실, 저자는 점점 더 셀 – 관통 및 항균 펩티드 1,8 사이의 관계를 지적했습니다. 멤브레인 translocation과 펩타이드 구조와 이동시키다하는 기능 사이의 관계 과정의 확실한 이해 translocation에 대한 효과적이고 재현성 assays가 필요합니다. 몇몇 그룹은 대형 unilamel로 translocation을 측정하는 방법을 제안했습니다고맙다 지질 vesicles (LUVs) 9-13. LUVs은 박테리아와 진핵 세포 점막에 대한 유용한 모델로 봉사하고 자주 펩타이드 형광 연구 14,15에 사용됩니다. 여기, 우리는 먼저 이러한 magainin 및 buforin II 16,17으로 항균 펩티드를 고려 마츠 및 동료에 의해 개발된 방법은 우리의 응용 프로그램을 설명합니다. 이 방법에 대한 우리의 프로토콜을 제공하는 것 외에도, 우리는이 분석을 사용하여 translocation 능력을 quantifies 데이터 분석에 대한 직접적인 접근 방식을 제시한다. 다른 사람에 비해이 translocation 분석의 장점은 멤브레인 translocation의 속도에 대한 정보를 제공하고 트립토판 함유 펩티드로, 펩타이드 특성 18을 변경할 수있는 형광 레이블의 추가를 필요로하지 않습니다 가능성을 가지고 있습니다. 간단히, 지질 vesicles로 translocation 능력은 기본 트립토판의 잔류물와 D 사이의 포스터 공명 에너지 전송 (걱정)의 함수로 측정단백질은 외부와 관련된 ansyl phosphatidylethanolamine은 멤브레인 (그림 1) LUV. 그들은 LUVs와 캡슐 노골적인 트립신 발생으로 휴대 관통 펩티드는 LUV 멤브레인 및 신호를 걱정의 드롭에서 disassociation로 이어지는, 죽습니다. 의 드롭 translocating 펩타이드에 대한 관찰 신호가 LUVs이 트립신 및 트립신 억제제, 또는 때 저절로 지질 세포막을 교차하지 않는 펩타이드가 트립신 함유 LUVs에 노출을 모두 포함하는 동일한 펩타이드에 대한 관찰보다 훨씬 큰 무서워. 형광에이 변경 사항은 시간이 지남에 따라 펩타이드 translocation의 직접 부량을 제공합니다.
Protocol
Discussion
여기에 제시 프로토콜은 내부 지질 vesicles 외부 펩티드의 농도에 상대적인 변화를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 변경 사항은 translocation 능력에 관련이 있습니다. 이 프로토콜은 약물 전달 벡터로서 잠재력을 지닌 세포 관통 펩티드를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 세포 관통 펩티드에 대한 흥미가 증가함에 따라, 직접 translocation 이벤트를 측정할 방법이 정량 방식으로 개발하고 사?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자가 도움이 토론에 대한 우리 부부는 플레밍과 제시카 첸 감사하고 싶습니다. 자금은 알레르기 및 전염병 국립 연구소 (NIH – NIAID) 수상 R15AI079685 및 연구 회사 Cottrell 대학 과학 수상에 의해 제공되었다. 추가 학생 지원은 하워드 휴즈 의학 연구소와 스탤리가 기금에 의해 제공되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 16:0-18:1 PG | Avanti Polar Lipids | 840457C |
| 1:18 Dansyl PE | Avanti Polar Lipids | 810330C |
| 16:0-18:1 PC | Avanti Polar Lipids | 850457C |
| Porcine trypsin | Sigma | T-0303 |
| Bowman-Birk trypsin/chymotrypsin inhibitor | Sigma | T-9777 |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 |
| Ammonium molybdate (para) | Alfa Aesar | 10811 |
| L-ascorbic acid | Sigma | A1417 |
| Hydrogen Peroxide, 30% solution | Mallinckrodt chemicals | 5240-05 |
| HEPES | Sigma | H-3375 |
| NaCl | Sigma | S-9625 |
| EDTA | Sigma | E5134 |
| NaH2PO4 | Sigma | S-0751 |
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