Måling Peptide translokasjon inn Large Unilamellar Blemmer
Summary
Denne protokollen detaljer en metode for kvantitativ måling av peptid translokasjon inn i store unilamellar lipid blemmer. Denne metoden gir også informasjon om graden av membran translokasjon og kan brukes til å identifisere peptider som effektivt og spontant krysse lipid bilayers.
Abstract
Det er en aktiv interesse i peptider som lett krysser cellemembranen uten hjelp av cellemembranen reseptorer 1. Mange av disse er referert til som celle-gjennomtrengende peptider, som er ofte kjent for sitt potensial som narkotika levering vektorer 1-3. Videre er det økende interesse for antimikrobielle peptider som opererer via non-membran lytisk mekanismer 4,5, spesielt de som krysser bakteriell membraner uten å forårsake cellelyse og dreper celler ved å forstyrre med intracellulære prosesser 6,7. Faktisk har forfatterne stadig påpekt forholdet mellom celle-gjennomtrengende og antimikrobielle peptider 1,8. En fast forståelse av prosessen med membran translokasjon og forholdet mellom peptid struktur og dens evne til å translocate krever effektive, reproduserbare analyser for translokasjon. Flere grupper har foreslått metoder for å måle translokasjon inn i store unilamelLar lipid vesikler (LUVs) 9-13. LUVs tjene som nyttige modeller for bakteriell og eukaryote cellemembraner og brukes ofte i peptid fluorescerende studier 14,15. Her beskriver vi vår bruk av metoden først utviklet av Matsuzaki og medarbeidere til å vurdere antimikrobielle peptider, som for eksempel magainin og buforin II 16,17. I tillegg til å gi vår protokoll for denne metoden, vi også presentere en grei tilnærming til data analyse som kvantifiserer translokasjon evne til å bruke denne analysen. Fordelene med denne translokasjon analysen i forhold til andre er at den har potensial til å gi informasjon om graden av membran translokasjon og krever ikke tillegg av et fluorescerende etikett, noe som kan endre peptid egenskaper 18, til tryptofan som inneholder peptider. Kort fortalt er translokasjon evne til lipid vesikler målt som en funksjon av Foster Resonance Energy Transfer (FRET) mellom innfødte tryptofan rester og dansyl phosphatidylethanolamine når proteiner er forbundet med den eksterne LUV membran (figur 1). Cell-gjennomtrengende peptider er kløyvde som de støter uhemmet trypsin innkapslet med LUVs, som fører til disassociation fra LUV membran og en nedgang i FRET signal. Fallet i FRET signal observert for en translocating peptid er betydelig større enn det som ble observert for den samme peptid når LUVs inneholder både trypsin og trypsin inhibitor, eller når et peptid som ikke spontant krysse lipid membraner er eksponert mot trypsin inneholder LUVs. Denne endringen i fluorescens gir en direkte kvantifisering av peptid translokasjon over tid.
Protocol
Discussion
Protokollen som presenteres her kan brukes til å vurdere den relative endringen i konsentrasjonen av peptider i og utenfor lipid blemmer. Disse endringene er knyttet til translokasjon evne. Denne protokollen kan brukes til å identifisere celle-gjennomtrengende peptider med potensial som narkotika levering vektorer. Som interesse i celle-gjennomtrengende peptider vokser, vil det være interessant å se hvordan metoder som direkte måler translokasjon arrangementet er utviklet og brukes i en kvantitativ måte.
<p cl…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Eleanor Fleming og Jessica Chen for nyttige diskusjoner. Finansieringen ble gitt av National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer (NIH-NIAID) Award R15AI079685 og Research Corporation Cottrell College Science Award. Ekstra student støtte ble gitt av Howard Hughes Medical Institute og Staley fond.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 16:0-18:1 PG | Avanti Polar Lipids | 840457C |
| 1:18 Dansyl PE | Avanti Polar Lipids | 810330C |
| 16:0-18:1 PC | Avanti Polar Lipids | 850457C |
| Porcine trypsin | Sigma | T-0303 |
| Bowman-Birk trypsin/chymotrypsin inhibitor | Sigma | T-9777 |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 |
| Ammonium molybdate (para) | Alfa Aesar | 10811 |
| L-ascorbic acid | Sigma | A1417 |
| Hydrogen Peroxide, 30% solution | Mallinckrodt chemicals | 5240-05 |
| HEPES | Sigma | H-3375 |
| NaCl | Sigma | S-9625 |
| EDTA | Sigma | E5134 |
| NaH2PO4 | Sigma | S-0751 |
References
- Henriques, S. T., Melo, M. N., Castanho, M. A. Cell-penetrating peptides and antimicrobial peptides: how different are they?. Biochem. J. 399 (1), 1-1 (2006).
- Trehin, R., Merkle, H. P. Chances and pitfalls of cell penetrating peptides for cellular drug delivery. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 209-209 (2004).
- Temsamani, J., Vidal, P. The use of cell-penetrating peptides for drug delivery. Drug Discov. Today. 9 (23), 1012-1012 (2004).
- Hale, J. D., Hancock, R. E. Alternative mechanisms of action of cationic antimicrobial peptides on bacteria. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 5 (6), 951-951 (2007).
- Nicolas, P., Rosenstein, Y. Multifunctional host defense peptides. FEBS J. 276 (22), 6464-6464 (2009).
- Boman, H. G., Agerberth, B., Boman, A. Mechanisms of Action on Escherichia-Coli of Cecropin-P1 and Pr-39, 2 Antibacterial Peptides from Pig Intestine. Infection and Immunity. 61 (7), 2978-2978 (1993).
- Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of action of the antimicrobial peptide buforin II: Buforin II kills microorganisms by penetrating the cell membrane and inhibiting cellular functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 244 (1), 253-253 (1998).
- Bobone, S. The thin line between cell-penetrating and antimicrobial peptides: the case of Pep-1 and Pep-1-K. J. Pept. Sci. 17 (5), 335-335 (2011).
- Marks, J. R., Placone, J., Hristova, K., Wimley, W. C. Spontaneous Membrane-Translocating Peptides by Orthogonal High-throughput Screening. J. Am. Chem. Soc.. , (2011).
- Rosenbluh, J. Translocation of histone proteins across lipid bilayers and Mycoplasma membranes. J. Mol. Biol. 345 (2), 387-387 (2005).
- Bárány-Wallje, E. A critical reassessment of penetratin translocation across lipid membranes. Biophys. J. 89 (4), 2513-2513 (2005).
- Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. Translocation of beta-galactosidase mediated by the cell-penetrating peptide pep-1 into lipid vesicles and human HeLa cells is driven by membrane electrostatic potential. Biochimie. 44 (30), 10189-10189 (2005).
- Orioni, B. Membrane perturbation by the antimicrobial peptide PMAP-23: a fluorescence and molecular dynamics study. Biochim. Biophys. Acta. 1788 (7), 1523-1523 (2009).
- Ladokhin, A. S., Jayasinghe, S., White, S. H. How to measure and analyze tryptophan fluorescence in membranes properly, and why bother?. Anal. Biochem. 285 (2), 235-235 (2000).
- Epand, R. M., Epand, R. F. Liposomes as models for antimicrobial peptides. Methods Enzymol. 372, 124-124 (2003).
- Kobayashi, S. Interactions of the novel antimicrobial peptide buforin 2 with lipid bilayers: Proline as a translocation promoting factor. Biochimie. 39 (29), 8648-8648 (2000).
- Matsuzaki, K., Murase, O., Fujii, N., Miyajima, K. Translocation of a channel-forming antimicrobial peptide, magainin 2, across lipid bilayers by forming a pore. Biochimie. 34 (19), 6521-6521 (1995).
- Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. Re-evaluating the role of strongly charged sequences in amphipathic cell-penetrating peptides: a fluorescence study using Pep-1. FEBS Lett. 579 (20), 4498-4498 (2005).
- Torchilin, V. P., Weissig, V. . Liposomes. , (2003).
- Almeida, P. F., Pokorny, A. Avanti Polar Lipids, Determination of Total Phosphorus. Biochimie. 1686 (34), 8083-8083 (2009).
- Kobayashi, S. Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2. Biochimie. 43 (49), 15610-15610 (2004).
