Medição Translocação Peptide em grandes vesículas Unilamelares
Summary
Este protocolo de detalhes um método para a medida quantitativa da translocação de peptídeos em grandes vesículas lipídicas unilamelares. Este método também fornece informações sobre a taxa de translocação de membrana e pode ser usado para identificar peptídeos que de forma eficiente e espontânea cruz bicamadas lipídicas.
Abstract
Há um interesse ativo em peptídeos que atravessam facilmente as membranas celulares sem a ajuda de receptores de membrana celular 1. Muitos destes são referidos como célula-penetrantes peptídeos, que são frequentemente conhecida por seu potencial como vetores de entrega de drogas 1-3. Além disso, há interesse crescente em peptídeos antimicrobianos, que funcionam através da membrana não-lítica mecanismos de 4,5, particularmente aqueles que atravessam as membranas bacterianas sem causar lise celular e matar as células, interferindo com processos intracelulares 6,7. De fato, os autores têm apontado cada vez mais o relacionamento entre peptídeos célula-penetrantes e antimicrobianos 1,8. Um firme entendimento do processo de translocação da membrana e da relação entre estrutura de peptídeo e sua capacidade de translocar requer eficaz, reprodutível para ensaios de translocação. Diversos grupos têm proposto métodos para medir a translocação para unilamel grandeslar vesículas lipídicas (luvs) 9-13. Luvs servir como modelos úteis para as membranas celulares bacterianas e eucarióticas e são freqüentemente usados em estudos de peptídeos fluorescentes 14,15. Aqui, descrevemos a nossa aplicação do primeiro método desenvolvido por Matsuzaki e colegas de trabalho a considerar peptídeos antimicrobianos, tais como magainin e II buforin 16,17. Além de fornecer o nosso protocolo para este método, apresentamos também uma abordagem simples para análise de dados que quantifica a capacidade de translocação com este ensaio. As vantagens deste ensaio translocação em relação aos outros é que ela tem o potencial para fornecer informações sobre a taxa de translocação de membrana e não requer a adição de uma etiqueta fluorescente, o que pode alterar as propriedades do peptídeo 18, a triptofano contendo peptídeos. Resumidamente, a capacidade de translocação em vesículas de lipídios é medido como uma função da Transferência de Energia Ressonância Foster (FRET) entre resíduos de triptofano nativas e dansyl fosfatidiletanolamina quando as proteínas estão associadas com a membrana externa LUV (Figura 1). Célula-penetrantes peptídeos são clivadas como eles encontram tripsina desinibida encapsulados com o luvs, levando a dissociação da membrana LUV e uma queda na FRET sinal. A queda na FRET sinal observado por um peptídeo translocação é significativamente maior do que a observada para o peptídeo mesmo quando o luvs contêm tanto tripsina e inibidor de tripsina, ou quando um peptídeo que não espontaneamente atravessar membranas lipídicas é exposto a tripsina contendo luvs. Esta mudança de fluorescência fornece uma quantificação direta de translocação de peptídeos ao longo do tempo.
Protocol
Discussion
O protocolo aqui apresentadas podem ser usados para avaliar a mudança relativa na concentração de peptídeos dentro e fora de vesículas lipídicas. Estas mudanças estão relacionadas à capacidade de translocação. Este protocolo pode ser usado para identificar células-penetrante peptídeos com potencial como vetores de entrega de drogas. Como o interesse na célula-penetrantes peptídeos cresce, ela vai ser interessante ver como os métodos que medem diretamente o evento de translocação são desenvolvida…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Eleanor Fleming e Jessica Chen para discussões úteis. O financiamento foi fornecido pelo Instituto Nacional de Alergias e Doenças Infecciosas (NIH-NIAID) Award e um R15AI079685 Research Corporation Cottrell Prêmio Faculdade de Ciências. Apoio ao estudante adicional foi fornecido pelo Instituto Médico Howard Hughes e do fundo de Staley.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 16:0-18:1 PG | Avanti Polar Lipids | 840457C |
| 1:18 Dansyl PE | Avanti Polar Lipids | 810330C |
| 16:0-18:1 PC | Avanti Polar Lipids | 850457C |
| Porcine trypsin | Sigma | T-0303 |
| Bowman-Birk trypsin/chymotrypsin inhibitor | Sigma | T-9777 |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 |
| Ammonium molybdate (para) | Alfa Aesar | 10811 |
| L-ascorbic acid | Sigma | A1417 |
| Hydrogen Peroxide, 30% solution | Mallinckrodt chemicals | 5240-05 |
| HEPES | Sigma | H-3375 |
| NaCl | Sigma | S-9625 |
| EDTA | Sigma | E5134 |
| NaH2PO4 | Sigma | S-0751 |
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