Mesure translocation peptide dans de grandes vésicules unilamellaires

Résumé

Ce protocole décrit une méthode pour la mesure quantitative de la translocation de peptide dans de grandes vésicules lipidiques unilamellaires. Cette méthode fournit également des informations sur le taux de translocation membranaire et peut être utilisé pour identifier des peptides qui servent efficacement et spontanément croisée bicouches lipidiques.

Résumé

Il ya un intérêt actif dans les peptides qui traversent facilement les membranes cellulaires sans l'aide de récepteurs membranaires des cellules ^1. Beaucoup d'entre eux sont appelés peptides de pénétration cellulaire, qui sont souvent connus pour leur potentiel en tant que vecteurs de délivrance de médicaments ^1-3. Par ailleurs, il ya un intérêt croissant dans des peptides antimicrobiens qui opèrent à travers la membrane des mécanismes non lytiques ^4,5, en particulier ceux qui traversent les membranes bactériennes sans causer la lyse des cellules et tuer les cellules en interférant avec les processus intracellulaires ^6,7. En fait, les auteurs ont de plus souligné la relation entre les peptides de pénétration cellulaire et antimicrobiennes ^1,8. Une bonne compréhension du processus de translocation membranaire et de la relation entre la structure peptide et sa capacité à déplacer doivent être effectives, des dosages reproductibles pour la translocation. Plusieurs groupes ont proposé des méthodes pour mesurer la translocation dans unilamel grandevésicules lipidiques LAR (LUV) ^9-13. LUV servir de modèles utiles pour les membranes cellulaires des bactéries et eucaryotes et sont fréquemment utilisés dans les études peptide fluorescent ^14,15. Ici, nous décrivons notre application de la première méthode développée par Matsuzaki et collègues à considérer les peptides antimicrobiens, tels que magainine et buforin II ^16,17. En plus d'offrir notre protocole pour cette méthode, nous présentons également une approche simple pour l'analyse de données qui quantifie la capacité de translocation par ce test. Les avantages de ce test de translocation par rapport aux autres est qu'il a le potentiel de fournir des informations sur le taux de translocation membranaire et ne nécessite pas l'ajout d'un marqueur fluorescent, ce qui peut modifier les propriétés de peptides ^18, peptides contenant du tryptophane. En bref, la capacité de translocation dans les vésicules lipidiques est mesurée en fonction du transfert Foster Resonance Energy (FRET) entre les résidus tryptophane natif et dansyl phosphatidyléthanolamine lorsque les protéines sont associées à la membrane externe LUV (figure 1). Pénétration cellulaire des peptides sont clivés en tant qu'ils rencontrent trypsine désinhibée encapsulé avec le GVU, conduisant à la dissociation de la membrane LUV et une baisse de signal de FRET. La baisse du signal de FRET observé pour un peptide translocation est significativement supérieure à celle observée pour la même peptide lorsque la LUV contiennent à la fois de la trypsine et l'inhibiteur de trypsine, ou quand un peptide qui n'apparaît pas spontanément de traverser les membranes lipidiques est exposé à la trypsine contenant LUV. Ce changement de fluorescence fournit une quantification directe de la translocation de peptide dans le temps.

Protocole

1. Préparation des grandes vésicules lipidiques unilamellaires (LUV)

1. Préparer LUV pour servir de membrane de la cellule imite pour le dosage ^19.
2. Phosphatidylcholine Mix (POPC, 760,10 g / mol), phosphatidylglycérol (POPG. 770,99 g / mol), 5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyle phosphatidyléthanolamine (DNS-PAPE, 994,350 g / mol) (Avanti Polar Lipids) dissous dans du chloroforme dans un 50 : ratio de 45:5. Comme chaque dosage nécessite la préparation séparée de LUV à la fois expérimentale et de contrôle, deux flacons gâteau lipidique doit être préparé. 0,376 mg de lipides totaux (0,188 mg de POPC, 0,169 POPG mg et 0,019 mg DNS-PAPE) est ....

Discussion

Le protocole présenté ici peut être utilisé pour évaluer la variation relative de la concentration des peptides à l'intérieur et en dehors des vésicules lipidiques. Ces changements sont liés à la capacité de translocation. Ce protocole peut être utilisé pour identifier des peptides de pénétration cellulaire avec un potentiel en tant que vecteurs de délivrance de médicaments. Comme l'intérêt pour les peptides de pénétration cellulaire se développe, il sera intéressant de voir comment les méthodes qui mesurent dir.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue
16:00-18:01 PG	Avanti Polar Lipids	840457C
01:18 Dansyl PE	Avanti Polar Lipids	810330C
16:00-18:01 PC	Avanti Polar Lipids	850457C
Trypsine porcine	Sigma	T-0303
Bowman-Birk trypsine / chymotrypsine inhibiteur de	Sigma	T-9777
Mini-extrudeuse	Avanti Polar Lipids	610000
Molybdate d'ammonium (para)	Alfa Aesar	10811
Acide L-ascorbique	Sigma	A1417
Peroxyde d'hydrogène, solution à 30%	Produits chimiques Mallinckrodt	5240-05
HEPES	Sigma	H-3375
NaCl	Sigma	S-9625
EDTA	Sigma	E5134
NaH 2 PO 4	Sigma	S-0751