Измерение пептида транслокации в Большой однослойные везикулы
Summary
Это детали протокола метод количественной мерой пептид транслокации в крупные однослойные везикулы липидов. Этот метод также дает информацию о скорости перемещения мембраны и может быть использована для идентификации пептидов, которые эффективно и спонтанно крест липидного бислоя.
Abstract
Существует активный интерес к пептидов, которые легко через клеточные мембраны без помощи рецепторами клеточной мембраны 1. Многие из них называют клеточной проникающих пептидов, которые часто отмечены за их потенциал в качестве вектора доставки лекарств 1-3. Более того, существует растущий интерес к антимикробных пептидов, которые работают не через мембраны литические механизмы 4,5, в особенности тех, которые пересекают мембран бактерий, не причиняя лизиса клеток и убивают клетки, влияя на внутриклеточные процессы 6,7. На самом деле, авторы все чаще указывали на связь между сотовыми-проникающей и антимикробных пептидов 1,8. Четкое представление о процессе перемещения мембраны и отношения между пептидной структуры и ее способность к транслокации требует эффективных, воспроизводимых анализов для транслокации. Несколько групп предложенных методов для измерения перемещения на большие unilamelЛар липидных везикул (БУВ) 9-13. БУВ послужить полезными моделями для бактериальных и эукариотических клеточных мембран и часто используются в пептидных флуоресцентных исследований 14,15. Здесь мы описываем наш применения метода впервые разработана Мацузаки и коллег рассмотреть антимикробные пептиды, такие как magainin и buforin II 16,17. В дополнение к предоставлению наш протокол для этого метода, мы также представляем прямой подход к анализу данных, которая количественно транслокации возможность использования этого теста. Преимущества этой транслокации анализа по сравнению с другими является то, что она имеет потенциал для предоставления информации о скорости перемещения мембраны и не требует добавления флуоресцентной метки, которые могут изменить свойства пептида 18, триптофан-содержащих пептидов. Короче говоря, способность транслокации в липидные пузырьки измеряется как функция энергии Фостер резонансной передачи (FRET) между родной остатков триптофана и гansyl фосфатидилэтаноламина, когда белки, связанные с внешними LUV мембраны (рис. 1). Cell-проникающих пептидов расщепляются, как они сталкиваются с раскованный трипсина инкапсулированные с БУВ, что приводит к отмежевание от LUV мембраны и падение FRET сигнала. Падение FRET сигнала наблюдается translocating пептида значительно больше, чем это наблюдалось за тот же пептид, когда БУВ содержать как трипсина и ингибитора трипсина, или когда пептид, который не спонтанно крест липидные мембраны подвергается трипсина содержащих БУВ. Это изменение флуоресценции обеспечивает прямое количественное пептидных транслокации с течением времени.
Protocol
Discussion
Протокол, представленные здесь может быть использован для оценки относительного изменения концентрации пептидов внутри и снаружи липидные пузырьки. Эти изменения связаны с перемещением способности. Этот протокол может быть использован для определения клеточного проникающих пептид…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Элеонора Флеминг и Джессика Чен за полезные обсуждения. Финансирование было предоставлено Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний (НИЗ-NIAID) Награда R15AI079685 и Research Corporation Коттрелл колледжа науки Award. Дополнительная поддержка студентов была предоставлена Медицинского института Говарда Хьюза и фонда Стейли.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 16:0-18:1 PG | Avanti Polar Lipids | 840457C |
| 1:18 Dansyl PE | Avanti Polar Lipids | 810330C |
| 16:0-18:1 PC | Avanti Polar Lipids | 850457C |
| Porcine trypsin | Sigma | T-0303 |
| Bowman-Birk trypsin/chymotrypsin inhibitor | Sigma | T-9777 |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 |
| Ammonium molybdate (para) | Alfa Aesar | 10811 |
| L-ascorbic acid | Sigma | A1417 |
| Hydrogen Peroxide, 30% solution | Mallinckrodt chemicals | 5240-05 |
| HEPES | Sigma | H-3375 |
| NaCl | Sigma | S-9625 |
| EDTA | Sigma | E5134 |
| NaH2PO4 | Sigma | S-0751 |
References
- Henriques, S. T., Melo, M. N., Castanho, M. A. Cell-penetrating peptides and antimicrobial peptides: how different are they?. Biochem. J. 399 (1), 1-1 (2006).
- Trehin, R., Merkle, H. P. Chances and pitfalls of cell penetrating peptides for cellular drug delivery. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 209-209 (2004).
- Temsamani, J., Vidal, P. The use of cell-penetrating peptides for drug delivery. Drug Discov. Today. 9 (23), 1012-1012 (2004).
- Hale, J. D., Hancock, R. E. Alternative mechanisms of action of cationic antimicrobial peptides on bacteria. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 5 (6), 951-951 (2007).
- Nicolas, P., Rosenstein, Y. Multifunctional host defense peptides. FEBS J. 276 (22), 6464-6464 (2009).
- Boman, H. G., Agerberth, B., Boman, A. Mechanisms of Action on Escherichia-Coli of Cecropin-P1 and Pr-39, 2 Antibacterial Peptides from Pig Intestine. Infection and Immunity. 61 (7), 2978-2978 (1993).
- Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of action of the antimicrobial peptide buforin II: Buforin II kills microorganisms by penetrating the cell membrane and inhibiting cellular functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 244 (1), 253-253 (1998).
- Bobone, S. The thin line between cell-penetrating and antimicrobial peptides: the case of Pep-1 and Pep-1-K. J. Pept. Sci. 17 (5), 335-335 (2011).
- Marks, J. R., Placone, J., Hristova, K., Wimley, W. C. Spontaneous Membrane-Translocating Peptides by Orthogonal High-throughput Screening. J. Am. Chem. Soc.. , (2011).
- Rosenbluh, J. Translocation of histone proteins across lipid bilayers and Mycoplasma membranes. J. Mol. Biol. 345 (2), 387-387 (2005).
- Bárány-Wallje, E. A critical reassessment of penetratin translocation across lipid membranes. Biophys. J. 89 (4), 2513-2513 (2005).
- Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. Translocation of beta-galactosidase mediated by the cell-penetrating peptide pep-1 into lipid vesicles and human HeLa cells is driven by membrane electrostatic potential. Biochimie. 44 (30), 10189-10189 (2005).
- Orioni, B. Membrane perturbation by the antimicrobial peptide PMAP-23: a fluorescence and molecular dynamics study. Biochim. Biophys. Acta. 1788 (7), 1523-1523 (2009).
- Ladokhin, A. S., Jayasinghe, S., White, S. H. How to measure and analyze tryptophan fluorescence in membranes properly, and why bother?. Anal. Biochem. 285 (2), 235-235 (2000).
- Epand, R. M., Epand, R. F. Liposomes as models for antimicrobial peptides. Methods Enzymol. 372, 124-124 (2003).
- Kobayashi, S. Interactions of the novel antimicrobial peptide buforin 2 with lipid bilayers: Proline as a translocation promoting factor. Biochimie. 39 (29), 8648-8648 (2000).
- Matsuzaki, K., Murase, O., Fujii, N., Miyajima, K. Translocation of a channel-forming antimicrobial peptide, magainin 2, across lipid bilayers by forming a pore. Biochimie. 34 (19), 6521-6521 (1995).
- Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. Re-evaluating the role of strongly charged sequences in amphipathic cell-penetrating peptides: a fluorescence study using Pep-1. FEBS Lett. 579 (20), 4498-4498 (2005).
- Torchilin, V. P., Weissig, V. . Liposomes. , (2003).
- Almeida, P. F., Pokorny, A. Avanti Polar Lipids, Determination of Total Phosphorus. Biochimie. 1686 (34), 8083-8083 (2009).
- Kobayashi, S. Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2. Biochimie. 43 (49), 15610-15610 (2004).
