La translocación de péptidos en la medición de grandes vesículas unilamelares
Summary
Este protocolo de detalles un método para la medición cuantitativa de la translocación de péptidos en grandes vesículas de lípidos unilamelares. Este método también proporciona información sobre la tasa de translocación de membrana y puede ser utilizado para identificar péptidos que de manera eficiente y espontáneamente bicapas lipídicas cruz.
Abstract
Hay un interés activo en péptidos que atraviesa fácilmente las membranas celulares sin la ayuda de los receptores de membrana de la célula 1. Muchos de estos se conocen como células de penetración de los péptidos, que con frecuencia se caracterizan por su potencial como vectores de administración de fármacos 1-3. Por otra parte, hay un creciente interés en los péptidos antimicrobianos que operan a través de mecanismos no-membrana lítica 4,5, en particular los que atraviesan las membranas bacterianas sin causar lisis celular y destruir las células al interferir con los procesos intracelulares 6,7. De hecho, los autores han señalado cada vez más la relación entre los péptidos penetran en las células y la resistencia a 1,8. Una sólida comprensión del proceso de translocación de membrana y la relación entre la estructura de péptidos y su capacidad para trasladar requiere ensayos de eficacia y reproducible para el desplazamiento. Varios grupos han propuesto métodos para medir el desplazamiento en gran unilamellar vesículas de lípidos (LUVs) 13.09. LUVs servir como modelos útiles para las membranas celulares bacterianas y eucariotas y se utilizan con frecuencia en estudios de péptido fluorescente 14,15. A continuación, describimos nuestra aplicación del primer método desarrollado por Matsuzaki y compañeros de trabajo para considerar los péptidos antimicrobianos, como Magainin y buforin II 16,17. Además de proporcionar el protocolo para este método, también presentamos un método directo para el análisis de datos que cuantifica la capacidad de desplazamiento utilizando este ensayo. Las ventajas de este ensayo de translocación en comparación con otros que tiene el potencial para proporcionar información sobre la tasa de translocación de membrana y no requiere la adición de una etiqueta fluorescente, que pueden alterar las propiedades del péptido 18, al triptófano que contienen péptidos. En pocas palabras, la capacidad de desplazamiento en las vesículas de lípidos se mide en función de la transferencia de energía Fomentar la resonancia (FRET) entre los residuos de triptófano nativos y dansyl fosfatidiletanolamina cuando las proteínas se asocian con la membrana externa LUV (Figura 1). Penetran en las células se rompen como los péptidos que se encuentran inhibidos tripsina encapsulada con la LUVs, lo que lleva a la disociación de la membrana LUV y la caída de la señal de FRET. La caída de la FRET señal observada para un péptido de translocación es significativamente mayor que la observada para el mismo péptido cuando el LUVs contener la tripsina y el inhibidor de tripsina, o cuando un péptido que no espontáneamente atravesar las membranas de lípidos está expuesto a la tripsina que contienen LUVs. Este cambio en la fluorescencia proporciona una cuantificación directa de la translocación de péptidos a través del tiempo.
Protocol
Discussion
El protocolo que aquí se presenta puede ser utilizado para evaluar el cambio relativo en la concentración de péptidos dentro y fuera de las vesículas lipídicas. Estos cambios están relacionados con la capacidad de desplazamiento. Este protocolo se puede utilizar para identificar penetran en las células péptidos con potencial como vectores de la administración de fármacos. Como el interés en la celda de penetración de los péptidos crece, será interesante ver cómo los métodos que miden directamente el caso…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Leonor Fleming y Chen Jessica útil para los debates. El financiamiento fue proporcionado por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIH-NIAID) y un Premio R15AI079685 Research Corporation Cottrell Premio Facultad de Ciencias. Apoyo a los estudiantes adicional fue proporcionada por el Instituto Médico Howard Hughes y el fondo de Staley.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 16:0-18:1 PG | Avanti Polar Lipids | 840457C |
| 1:18 Dansyl PE | Avanti Polar Lipids | 810330C |
| 16:0-18:1 PC | Avanti Polar Lipids | 850457C |
| Porcine trypsin | Sigma | T-0303 |
| Bowman-Birk trypsin/chymotrypsin inhibitor | Sigma | T-9777 |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 |
| Ammonium molybdate (para) | Alfa Aesar | 10811 |
| L-ascorbic acid | Sigma | A1417 |
| Hydrogen Peroxide, 30% solution | Mallinckrodt chemicals | 5240-05 |
| HEPES | Sigma | H-3375 |
| NaCl | Sigma | S-9625 |
| EDTA | Sigma | E5134 |
| NaH2PO4 | Sigma | S-0751 |
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