Mätning Peptide Translokation i stora Unilamellar Blåsor
Summary
Detta protokoll detaljer en metod för kvantitativ mätning av peptiden translokation i stora unilamellar lipid blåsor. Denna metod ger också information om graden av membranet translokation och kan användas för att identifiera peptider som effektivt och spontant över lipid bilayers.
Abstract
Det finns ett aktivt intresse för peptider som lätt passera cellmembran utan hjälp av receptorer på cellens membran 1. Många av dessa kallas cell-penetrerande peptider, som ofta är kända för sin potential som drug delivery vektorer 1-3. Dessutom finns ett ökat intresse för antimikrobiella peptider som verkar via icke-membran lytisk mekanismer 4,5, särskilt de som korsar bakteriemembran utan att orsaka cellslys och döda celler genom att störa intracellulära processer 6,7. I själva verket har författarna pekat alltmer ut förhållandet mellan cell-penetrerande och antimikrobiella peptider 1,8. En fast förståelse av processen membranet translokation och förhållandet mellan peptiden struktur och dess förmåga att translocate kräver effektiv, reproducerbara analyser för translokation. Flera grupper har föreslagit metoder för att mäta translokation i stora unilamelLAR lipid blåsor (LUVS) 9-13. LUVS fungera som användbara modeller för bakterier och eukaryota cellens membran och används ofta i peptid fluorescerande studier 14,15. Här beskriver vi vår tillämpning av metoden utvecklades först av Matsuzaki och medarbetare att överväga antimikrobiella peptider, som magainin och buforin II 16,17. Förutom att ge våra protokoll för denna metod, presenterar vi också en enkel metod för analys av data som anger translokationen förmåga att använda denna analys. Fördelarna med denna translokation analys jämfört med andra är att den har potential att ge information om graden av membranet förflyttning och inte kräver tillsats av en fluorescerande märkningen, som kan förändra peptid egenskaper 18, tryptofan som innehåller peptider. Kortfattat är translokation förmågan till lipid blåsor mätt som en funktion av Foster Resonance Energy Transfer (FRET) mellan infödda tryptofan rester och dansyl fosfatidyletanolamin när proteiner associerade med externa LUV membran (figur 1). Cellpenetrerande peptider klyvs när de möter hämningslös trypsin inkapslad med LUVS, vilket leder till avståndstagande från LUV membranet och en nedgång i FRET signal. Nedgången i FRET signalen observeras under en translocating peptid är betydligt större än den som observerades för samma peptiden när LUVS innehåller både trypsin och trypsin inhibitor, eller när en peptid som inte spontant över lipid membraner är utsatt för trypsin innehåller LUVS. Denna förändring i fluorescens ger en direkt kvantifiering av peptid translokationen över tiden.
Protocol
Discussion
Protokollet presenteras här kan användas för att bedöma den relativa förändringen i koncentration av peptider i och utanför lipid blåsor. Dessa förändringar är relaterade till translokation förmåga. Detta protokoll kan användas för att identifiera cellpenetrerande peptider med potential som vektorer drug delivery. Liksom intresset för cell-penetrerande peptider växer, kommer det att bli intressant att se hur metoder som direkt mäter translokation händelsen utvecklas och användas i en kvantitativ sät…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Eleanor Fleming och Jessica Chen för bra diskussioner. Finansieringen kom från National Institute of Allergy och infektionssjukdomar (NIH-NIAID) Tilldelningskriterier R15AI079685 och Research Corporation Cottrell College Science Award. Ytterligare studentstöd lämnades av Howard Hughes Medical Institute och Staley fonden.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 16:0-18:1 PG | Avanti Polar Lipids | 840457C |
| 1:18 Dansyl PE | Avanti Polar Lipids | 810330C |
| 16:0-18:1 PC | Avanti Polar Lipids | 850457C |
| Porcine trypsin | Sigma | T-0303 |
| Bowman-Birk trypsin/chymotrypsin inhibitor | Sigma | T-9777 |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 |
| Ammonium molybdate (para) | Alfa Aesar | 10811 |
| L-ascorbic acid | Sigma | A1417 |
| Hydrogen Peroxide, 30% solution | Mallinckrodt chemicals | 5240-05 |
| HEPES | Sigma | H-3375 |
| NaCl | Sigma | S-9625 |
| EDTA | Sigma | E5134 |
| NaH2PO4 | Sigma | S-0751 |
References
- Henriques, S. T., Melo, M. N., Castanho, M. A. Cell-penetrating peptides and antimicrobial peptides: how different are they?. Biochem. J. 399 (1), 1-1 (2006).
- Trehin, R., Merkle, H. P. Chances and pitfalls of cell penetrating peptides for cellular drug delivery. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 209-209 (2004).
- Temsamani, J., Vidal, P. The use of cell-penetrating peptides for drug delivery. Drug Discov. Today. 9 (23), 1012-1012 (2004).
- Hale, J. D., Hancock, R. E. Alternative mechanisms of action of cationic antimicrobial peptides on bacteria. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 5 (6), 951-951 (2007).
- Nicolas, P., Rosenstein, Y. Multifunctional host defense peptides. FEBS J. 276 (22), 6464-6464 (2009).
- Boman, H. G., Agerberth, B., Boman, A. Mechanisms of Action on Escherichia-Coli of Cecropin-P1 and Pr-39, 2 Antibacterial Peptides from Pig Intestine. Infection and Immunity. 61 (7), 2978-2978 (1993).
- Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of action of the antimicrobial peptide buforin II: Buforin II kills microorganisms by penetrating the cell membrane and inhibiting cellular functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 244 (1), 253-253 (1998).
- Bobone, S. The thin line between cell-penetrating and antimicrobial peptides: the case of Pep-1 and Pep-1-K. J. Pept. Sci. 17 (5), 335-335 (2011).
- Marks, J. R., Placone, J., Hristova, K., Wimley, W. C. Spontaneous Membrane-Translocating Peptides by Orthogonal High-throughput Screening. J. Am. Chem. Soc.. , (2011).
- Rosenbluh, J. Translocation of histone proteins across lipid bilayers and Mycoplasma membranes. J. Mol. Biol. 345 (2), 387-387 (2005).
- Bárány-Wallje, E. A critical reassessment of penetratin translocation across lipid membranes. Biophys. J. 89 (4), 2513-2513 (2005).
- Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. Translocation of beta-galactosidase mediated by the cell-penetrating peptide pep-1 into lipid vesicles and human HeLa cells is driven by membrane electrostatic potential. Biochimie. 44 (30), 10189-10189 (2005).
- Orioni, B. Membrane perturbation by the antimicrobial peptide PMAP-23: a fluorescence and molecular dynamics study. Biochim. Biophys. Acta. 1788 (7), 1523-1523 (2009).
- Ladokhin, A. S., Jayasinghe, S., White, S. H. How to measure and analyze tryptophan fluorescence in membranes properly, and why bother?. Anal. Biochem. 285 (2), 235-235 (2000).
- Epand, R. M., Epand, R. F. Liposomes as models for antimicrobial peptides. Methods Enzymol. 372, 124-124 (2003).
- Kobayashi, S. Interactions of the novel antimicrobial peptide buforin 2 with lipid bilayers: Proline as a translocation promoting factor. Biochimie. 39 (29), 8648-8648 (2000).
- Matsuzaki, K., Murase, O., Fujii, N., Miyajima, K. Translocation of a channel-forming antimicrobial peptide, magainin 2, across lipid bilayers by forming a pore. Biochimie. 34 (19), 6521-6521 (1995).
- Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. Re-evaluating the role of strongly charged sequences in amphipathic cell-penetrating peptides: a fluorescence study using Pep-1. FEBS Lett. 579 (20), 4498-4498 (2005).
- Torchilin, V. P., Weissig, V. . Liposomes. , (2003).
- Almeida, P. F., Pokorny, A. Avanti Polar Lipids, Determination of Total Phosphorus. Biochimie. 1686 (34), 8083-8083 (2009).
- Kobayashi, S. Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2. Biochimie. 43 (49), 15610-15610 (2004).
