Måling peptid translokation i store Unilamellar Vesikler
Summary
Denne protokol nærmere en metode til kvantitativ måling af peptid translokation i store unilamellar lipid vesikler. Denne metode giver også oplysninger om antallet af membranen translokation og kan bruges til at identificere peptider, der effektivt og spontant på tværs lipid dobbeltlag.
Abstract
Der er en aktiv interesse i peptider, der let passerer cellemembraner, uden bistand fra cellens membran receptorer 1. Mange af disse er nævnt som celle-gennemtrængende peptider, der ofte er kendt for deres potentiale som drug delivery vektorer 1-3. Desuden er der stigende interesse for antimikrobielle peptider, der opererer via ikke-membran lytiske mekanismer 4,5, især dem, der krydser bakterielle membraner uden at forårsage cellelysis og dræbe celler ved at gribe ind med intracellulære processer 6,7. Faktisk har forfatterne i stigende grad påpeget sammenhængen mellem celle-gennemtrængende og antimikrobielle peptider 1,8. En fast forståelse af processen med at membranen translokation og forholdet mellem peptid struktur og dens evne til at translocate kræver effektive, reproducerbare assays til translokation. Flere grupper har foreslået metoder til at måle translokation i store unilamelLAR lipid vesikler (LUVs) 9-13. LUVs tjene som nyttige modeller for bakterier og eukaryote cellemembraner, og bruges ofte i peptid fluorescerende undersøgelser 14,15. Her beskriver vi vores anvendelse af metoden først udviklet af Matsuzaki og medarbejdere til at overveje antimikrobielle peptider, som magainin og buforin II 16,17. Ud over at give vores protokol for denne metode, vi også præsentere en enkel tilgang til data analyse, der kvantificerer translokation evne til at bruge denne analyse. Fordelene ved denne translokation analyse i forhold til andre er, at det har potentiale til at give oplysninger om antallet af membranen translokation og ikke kræver tilsætning af en fluorescerende etiket, som kan ændre peptid egenskaber 18, til tryptofan-holdige peptider. Kort fortalt, er translokation evnen til lipid vesikler målt som en funktion af Foster Resonance Energy Transfer (FRET) mellem indfødte tryptophan rester og dansyl phosphatidylethanolamin når proteiner er forbundet med den eksterne LUV membran (Figur 1). Cell-gennemtrængende peptider spaltes, som de støder på uhæmmet trypsin indkapslet med LUVs, der fører til afstandtagen fra LUV membran og et fald i FRET signal. Faldet i FRET signal er observeret for et translocating peptid er væsentligt større end den observeret for de samme peptid, når LUVs indeholder både trypsin og trypsin inhibitor, eller når et peptid, der ikke spontant krydser lipid membraner er eksponeret over for trypsin-holdige LUVs. Denne ændring i fluorescens giver en direkte kvantificering af peptid translokation over tid.
Protocol
Discussion
Den protokol, der præsenteres her, kan bruges til at vurdere den relative ændring i koncentrationen af peptider i og uden for lipid vesikler. Disse ændringer er relateret til translokation evne. Denne protokol kan bruges til at identificere celle-gennemtrængende peptider med potentiale som drug delivery vektorer. Efterhånden som interessen i celle-gennemtrængende peptider vokser, vil det være interessant at se, hvordan metoder, der direkte måler translokationen begivenheden er udviklet og bruges i en kvant…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Eleanor Fleming og Jessica Chen for nyttige diskussioner. Finansieringen blev leveret af National Institute of Allergy og smitsomme sygdomme (NIH-NIAID) Tildelingskriterier R15AI079685 og en Research Corporation Cottrell College Science Award. Ekstra elev Støtten blev givet af Howard Hughes Medical Institute og Staley fond.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 16:0-18:1 PG | Avanti Polar Lipids | 840457C |
| 1:18 Dansyl PE | Avanti Polar Lipids | 810330C |
| 16:0-18:1 PC | Avanti Polar Lipids | 850457C |
| Porcine trypsin | Sigma | T-0303 |
| Bowman-Birk trypsin/chymotrypsin inhibitor | Sigma | T-9777 |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 |
| Ammonium molybdate (para) | Alfa Aesar | 10811 |
| L-ascorbic acid | Sigma | A1417 |
| Hydrogen Peroxide, 30% solution | Mallinckrodt chemicals | 5240-05 |
| HEPES | Sigma | H-3375 |
| NaCl | Sigma | S-9625 |
| EDTA | Sigma | E5134 |
| NaH2PO4 | Sigma | S-0751 |
References
- Henriques, S. T., Melo, M. N., Castanho, M. A. Cell-penetrating peptides and antimicrobial peptides: how different are they?. Biochem. J. 399 (1), 1-1 (2006).
- Trehin, R., Merkle, H. P. Chances and pitfalls of cell penetrating peptides for cellular drug delivery. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 209-209 (2004).
- Temsamani, J., Vidal, P. The use of cell-penetrating peptides for drug delivery. Drug Discov. Today. 9 (23), 1012-1012 (2004).
- Hale, J. D., Hancock, R. E. Alternative mechanisms of action of cationic antimicrobial peptides on bacteria. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 5 (6), 951-951 (2007).
- Nicolas, P., Rosenstein, Y. Multifunctional host defense peptides. FEBS J. 276 (22), 6464-6464 (2009).
- Boman, H. G., Agerberth, B., Boman, A. Mechanisms of Action on Escherichia-Coli of Cecropin-P1 and Pr-39, 2 Antibacterial Peptides from Pig Intestine. Infection and Immunity. 61 (7), 2978-2978 (1993).
- Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of action of the antimicrobial peptide buforin II: Buforin II kills microorganisms by penetrating the cell membrane and inhibiting cellular functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 244 (1), 253-253 (1998).
- Bobone, S. The thin line between cell-penetrating and antimicrobial peptides: the case of Pep-1 and Pep-1-K. J. Pept. Sci. 17 (5), 335-335 (2011).
- Marks, J. R., Placone, J., Hristova, K., Wimley, W. C. Spontaneous Membrane-Translocating Peptides by Orthogonal High-throughput Screening. J. Am. Chem. Soc.. , (2011).
- Rosenbluh, J. Translocation of histone proteins across lipid bilayers and Mycoplasma membranes. J. Mol. Biol. 345 (2), 387-387 (2005).
- Bárány-Wallje, E. A critical reassessment of penetratin translocation across lipid membranes. Biophys. J. 89 (4), 2513-2513 (2005).
- Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. Translocation of beta-galactosidase mediated by the cell-penetrating peptide pep-1 into lipid vesicles and human HeLa cells is driven by membrane electrostatic potential. Biochimie. 44 (30), 10189-10189 (2005).
- Orioni, B. Membrane perturbation by the antimicrobial peptide PMAP-23: a fluorescence and molecular dynamics study. Biochim. Biophys. Acta. 1788 (7), 1523-1523 (2009).
- Ladokhin, A. S., Jayasinghe, S., White, S. H. How to measure and analyze tryptophan fluorescence in membranes properly, and why bother?. Anal. Biochem. 285 (2), 235-235 (2000).
- Epand, R. M., Epand, R. F. Liposomes as models for antimicrobial peptides. Methods Enzymol. 372, 124-124 (2003).
- Kobayashi, S. Interactions of the novel antimicrobial peptide buforin 2 with lipid bilayers: Proline as a translocation promoting factor. Biochimie. 39 (29), 8648-8648 (2000).
- Matsuzaki, K., Murase, O., Fujii, N., Miyajima, K. Translocation of a channel-forming antimicrobial peptide, magainin 2, across lipid bilayers by forming a pore. Biochimie. 34 (19), 6521-6521 (1995).
- Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. Re-evaluating the role of strongly charged sequences in amphipathic cell-penetrating peptides: a fluorescence study using Pep-1. FEBS Lett. 579 (20), 4498-4498 (2005).
- Torchilin, V. P., Weissig, V. . Liposomes. , (2003).
- Almeida, P. F., Pokorny, A. Avanti Polar Lipids, Determination of Total Phosphorus. Biochimie. 1686 (34), 8083-8083 (2009).
- Kobayashi, S. Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2. Biochimie. 43 (49), 15610-15610 (2004).
