Nous décrivons comment effectuer des infections rétrovirales ou lentiviraux de la surexpression ou de shRNA contenant des constructions dans les cellules B humaines Ramos en ligne et comment mesurer hypermutation somatique dans ces cellules.
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Article de méthode
Évaluer hypermutation somatique dans les cellules B Ramos, après surexpression ou Knockdown de gènes spécifiques
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cellules B commencent leur vie avec des anticorps de faible affinité générés par V (D) J. Toutefois, après la détection d'un pathogène, la variable (V) la région d'une immunoglobuline (Ig) gène est muté environ 100.000 fois plus que le reste du génome grâce à hypermutation somatique (SHM), résultant de l'affinité des anticorps 1,2 de haut. De plus, la commutation isotypique (CSR) produit des anticorps avec les différentes fonctions effectrices selon le type de réponse immunitaire qui est nécessaire pour un agent pathogène particulier. Tant en matière de RSE et la SHM sont initiées par la cytidine désaminase induite par activation (AID), qui désamine résidus cytosine dans l'ADN pour produire uraciles. Ces uraciles sont traitées par des formes d'erreurs des voies de réparation, pour aboutir finalement à des mutations et recombinaisons 1-3.
Notre compréhension actuelle des détails moléculaires de SHM et la RSE proviennent d'une combinaison d'études chez la souris, des cellules primaires, lignées cellulaires et des cellules-fexpériences ree. Des modèles murins reste l'étalon-or avec des KO génétique montrant des rôles essentiels pour de nombreux facteurs de réparation (par exemple Ung, MSH2, MSH6, Exo1, et la polymérase η) 4-10. Cependant, tous les gènes sont susceptibles d'études à élimination directe. Par exemple, KO de plusieurs double-brin de protéines de réparation des cassures sont embryonnaire létal ou altérer développement des cellules B 11-14. D'ailleurs, parfois la fonction spécifique d'une protéine dans SHM ou RSE peuvent être masqués par plusieurs défauts mondial causé par les huitièmes de finale. En outre, depuis les expériences chez la souris peut être long, en modifiant l'expression des gènes individuels dans des lignées cellulaires est devenu une étape plus populaire d'abord identifier et caractériser les gènes candidats 15-18.
Ramos - une ligne de lymphome de Burkitt qui subit constitutivement SHM - a été un populaire lignée cellulaire modèle pour étudier SHM 18-24. Un avantage de cellules Ramos, c'est qu'ils ont un semi intégré pratique-Quantitative mesure de SHM. Cellules de type sauvage d'exprimer des IgM et, comme ils prennent des mutations, certaines mutations assommer l'expression d'IgM. Par conséquent, le dosage de la perte d'IgM par la numérisation des cellules activées par fluorescence (FACS) fournit un moyen rapide de lecture pour le niveau de SHM. Une mesure plus quantitative de la SHM peut être obtenu par séquençage direct des gènes d'anticorps.
Comme les cellules Ramos sont difficiles à transfecter, nous produisons des dérivés stables qui ont augmenté ou abaissé expression d'un gène particulier en infectant les cellules avec des constructions rétrovirales ou lentiviraux qui contiennent soit une cassette surexpression ou une épingle à cheveux courts ARN (shRNA), respectivement. Ici, nous décrivons comment nous infecter les cellules Ramos et ensuite utiliser ces cellules pour étudier le rôle des gènes spécifiques sur SHM (figure 1).
Protocole
1. Préparation des échantillons et les cellules
- Effectuer une préparation à moyenne échelle de l'ADN (Midiprep) de la surexpression ou shRNA contenant des constructions et de l'emballage vecteur rétroviral pKat2 ou les vecteurs lentiviraux emballage pVSV-G, pMDLg / pRRE et pRSV-Rev 25. Utilisez 6 ug d'ADN pour chaque construction et soit 4 pg d'pKat2 (pour infections rétrovirales) ou 1,5 ug d'ADN pour chacun des pVSV-g, pMDLg / pRRE, et les vecteurs d'emballage pRSV-Rev (pour les infections lentiviraux).
- Préparer BOSC 23 médias. Pour la transfection, utilisez les deux moyennes non amendée Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), ainsi que du....
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Discussion
Comme indiqué précédemment, les modèles de la lignée cellulaire pour la diversification des anticorps sont devenus un point de départ pour identifier de nouvelles protéines qui influencent les différentes étapes au cours de diversification des anticorps. Nous présentons ici une méthode pour utiliser une infection virale à des protéines soit le knock-down ou une surexpression dans les cellules B Ramos ligne et ensuite d'examiner l'impact sur la SHM.
Pour ces études, nous utilisons deu.......
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Déclarations de divulgation
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Remerciements
Le pMSCV-AID-I-Thy1.1 et pKat2 vecteurs ont été un cadeau aimable de la DG Schatz et l'pVSV-G, pRSV-Rev, et pMDLg / pRRE vecteurs ont été un cadeau du genre BR Cullen.
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Matériaux
Réactifs suggérée - la plupart d'entre eux peuvent être remplacés par des produits similaires d'autres fournisseurs.
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Société | Numéro de catalogue | Commentaires |
| 6-même évident TC-traitée plaques | Corning | 3516 | |
| 10 ml BD Luer-Loksyringes | BD Medical | 309604 | |
| 24 puits claires TC-traitée plaques | Corning | 3526 | |
| 96 puits à fond plat en polystyrène transparent TC-traitée microplaques | Corning | 3596 | |
| 100 mm boîtes de culture TC-traitée | Corning | 430167 | |
| Filtres pour seringue Acrodisc, 0,45 um | Pall Life Sciences | 4604 | |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Ampicilline | Sigma | A0166 | 100 mg / mL dans l'eau |
| BD FACSCanto cytomètre en flux II | BD Biosciences | ou similaire | |
| BD Falcon tubes ronds en polystyrène en bas | BD Biosciences | 352054 | pour la FACS |
| BOSC 23 cellules | ATCC | CRL-11270 | |
| CO 2 capable d'incubateur 37 ° C | |||
| DMEM (milieu de Dulbecco modifié Eagle) | Sigma | D6429 | |
| FBS (sérum de veau fœtal) | Gemini Bio-Produits | 100-106 | |
| FITC α-rat CD90/mouse CD90.1 d'anticorps | BioLegend | 202503 | FITCα-Thy1.1 |
| Réactif de transfection FuGENE 6 | Roche | 11814443001 | |
| Solution tampon HEPES | Invitrogen | 15630-080 | |
| Polymérase ADN KAPA HiFi | KAPA Biosystems | KK2101 | |
| LB Broth (bouillon de lysogénie - Luria) Poudre | Difco | 240230 | |
| MISSION TRC shRNA stocks de glycérol bactérienne | Sigma | vecteurs shRNA | |
| NCS (sérum de veau nouveau-né) | Gemini Bio-Produits | 100-504 | |
| PBS (solution tampon phosphate) | Invitrogen | 70011 | diluée dans de l'eau à 1x |
| PE α-humain IgM | BioLegend | 314508 | |
| PGS (pénicilline-streptomycine-glutamine solution) | Gemini Bio-Produits | 400-110 | |
| Polybrène (hexadiméthrine bromure) | Sigma | 107689 | 10 mg / mL dans l'eau |
| PureYield système plasmidique Midiprep | Promega | A2495 | |
| Puromycine | Sigma | P8833 | 250 pg / mL dans l'eau |
| QIAquick gel extraction kit | QIAGEN | 28706 | |
| Ramos (PR 1) des cellules | ATCC | LCR-1596 | |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | |
| SuperScript II | Invitrogen | 18064-022 | |
| SYBR FAST qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4601 | |
| Taq ADN polymérase | Invitrogen | 18038-042 | |
| TOPO TA Cloning kit | InvitroGen | K4520-01 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596-026 | |
| Assistant Genomic DNA SV système de purification | Promega | A2361 | |
| X-Gal [5-bromo-4-chloro-3-β-indoyl-D-galatopyranoside] | Growcells | C-5687 | 40 mg / ml dans le DMSO |
Références
- Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation. Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).
- Peled, J. U. The biochemistry of somatic hypermutation. Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).
- Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U.
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