Ekspression Analyse af mammale Linker-histon Undertyper
Summary
Beskriver vi en række assays til at analysere ekspressionsniveauer af H1 linker histoner. mRNA individuelle H1 gener kvantitativt ved tilfældig primer baseret revers transkription efterfulgt af real-time PCR, hvorimod protein kvantificering af H1 histoner opnås ved HPLC-analyse.
Abstract
Linkeren histon H1 binder til nukleosom kernepartikel og linker-DNA, der letter foldningen af kromatin i højere orden struktur. H1 er afgørende for pattedyr udvikling 1 og regulerer genekspression in vivo 2-4. Blandt de højkonserverede histon proteiner, er familien af H1 linkersekvenser histoner mest heterogen gruppe. Der er 11 H1 undertyper i pattedyr, der differentielt reguleret under udvikling og i forskellige celletyper. Disse H1 undertyper omfatter 5 somatiske H1S (H1A-e), udskiftning H1 0, 4 kønsceller specifikke H1 undertyper, og H1x 5. Tilstedeværelsen af multiple H1 undertyper, der afviger i DNA bindingsaffinitet og chromatin kompaktering evne 6-9 tilvejebringer et yderligere modulation af kromatin funktion. Således kvantitativt udtryk analyse af de enkelte H1 undertyper, både mRNA og proteiner, er nødvendig for en bedre forståelse af reguleringen af højereFor chromatin struktur og funktion.
Her beskriver vi en række assays designet til at analysere ekspressionsniveauerne af individuelle H1 undertype (figur 1). mRNA-ekspression af forskellige H1 variantgener måles ved en række af meget følsomme og kvantitativ revers transkription-PCR (QRT-PCR) assays, der er hurtigere og mere præcis og kræver meget mindre prøver sammenlignet med den alternative fremgangsmåde til Northern blot-analyse. I modsætning til andre cellulære mRNA meddelelser, mangler mRNA'er for de fleste histon gener, herunder størstedelen af H1 gener, en lang polyA hale, men indeholder en stilk-loop-struktur i 3'-utranslaterede region (UTR) 10. Derfor er cDNA'er fremstillet fra totalt RNA ved revers transkription under anvendelse af tilfældige primere i stedet for oligo-dT-primere. Realtid PCR-assays med primere specifikke for hver H1 undertype (tabel 1) udføres for at opnå meget kvantitativ måling af mRNA-niveauer af individuelle H1 undertypesek. Angivelse af rengøring gener analyseres som kontrol for normalisering.
Den relative rigelighed af proteiner af hver H1 undertype og kerne histoner opnås ved omvendt fase højtydende væskekromatografi (RP-HPLC)-analyse af totalt histoner ekstraheret fra pattedyrceller 11-13. HPLC-metoden og elueringsbetingelser beskrevet her give optimale separation af muse H1 undertype. Ved kvantificering HPLC profil, beregner vi den relative andel af de individuelle H1 undertype i H1 familien, såvel som bestemmelse af H1 nukleosom forholdet i cellerne.
Protocol
Discussion
Sættet af assays præsenteret her muliggøre omfattende analyse af ekspressionsniveauerne af mammale linker histon undertyper. Korrekt udformet QRT-PCR assays tilvejebringe meget følsomme og nøjagtige målinger af RNA meddelelser fra alle pattedyr histon H1 gener. Den kritiske del af QRT-PCR assays til linkergrupper histon subtype gener er fremstillingen af cDNA under anvendelse af vilkårlig primer baseret revers transkription. mRNA mest histon gener, herunder de fleste H1 gener, som ikke indeholder en lang po…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er støttet af NIH tilskud GM085261 og Georgien Cancer Coalition Distinguished Scholar Award (til YF).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780 |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-018 |
| SuperScriptIII | Invitrogen | 18080-051 |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 |
| IQ SYBR Green | Bio-Rad | 170-8880 |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | AMP-D1 |
| Microseal 96-well PCR plate | Bio-Rad | MSP-9605 |
| Microseal ‘B’ Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 |
| Sucrose | Agros Organics | AC40594 |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP332 |
| Sodium chloride (NaCl) | American Bioanalytical | AB01915 |
| Sodium dihydrogen phosphate heptahydrate (NaH2PO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP-330 |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 |
| Complete Mini proteinase inhibitor cocktail tablet | Roche Applied Science | 11836153001 |
| EDTA | Sigma | E-5134 |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | American Bioanalytical | AB01620 |
| Nonidet-40 (NP-40) | American Bioanalytical | AB01425 |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 |
| Tris [hydroxymethyl aminomethane] | American Bioanalytical | AB02000 |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | VWR | VW3648-3 |
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Agros Organics | AC42330 |
| Bradford Protein Assay | Bio-Rad | 500-0001 |
| Acetonitrile | EMD | AX0145-1 |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | J.T.Baker | 9470-01 |
References
- Fan, Y. H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo. Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).
- Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length. Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).
- Shen, X., Gorovsky, M. A. Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo. Cell. 86, 475-483 (1996).
- Alami, R. Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5920-5925 (2003).
- Happel, N., Doenecke, D. Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function. Gene. 431, 1-12 (2009).
- Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI/SNF or NURF. PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).
- Khadake, J. R., Rao, M. R. DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin. Biochimie. 34, 15792-15801 (1995).
- Orrego, M. Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin. BMC Biol. 5, 22-22 (2007).
- Th’ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain. J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).
- Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation. J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).
- Brown, D. T., Sittman, D. B. Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes. J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).
- Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype. Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).
- Fan, Y., Skoultchi, A. I. Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice. Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996).
