포유류의 링커 - 히스톤 Subtypes의 표현 분석
Summary
우리는 H1의 링커 histones의 표현 수준을 분석 assays 집합을 설명합니다. H1의 histones의 단백질 양을 정함은 HPLC 분석에 의해 달성되는 반면, 개별 H1 유전자의 mRNA는 정량적 실시간 PCR 다음에 임의의 프라이머 기반 역방향 전사로 측정됩니다.
Abstract
링커 히스톤 H1 높은 순서 구조로 염색질의 접이식 촉진, nucleosome 핵심 입자와 링커 DNA에 바인딩합니다. H1은 포유류의 개발 1 필수적이며, 생체내 2-4 특정 유전자 발현을 조절. 고도 보존 히스톤 단백질 중에서 H1의 링커 histones의 가족은 가장 이질적인 그룹입니다. differentially 개발되는 동안 서로 다른 세포 유형의 규제 포유류 11 H1의 subtypes가 있습니다. 이러한 H1의 subtypes 5 체세포 H1s (H1a-E), 교체 H1 0, 4 배아 세포 특정 H1의 subtypes 및 H1x 5 포함되어 있습니다. DNA와 결합 친화성 및 염색질 압축 능력 6-9에 차이가 여러 H1의 subtypes의 존재는 염색질 기능의 변조의 추가 레벨을 제공합니다. 따라서 mRNA와 단백질의 두 개별 H1의 subtypes의 양적 표현 분석은, 이상의 규정의 이해에 필요한주문 염색질 구조와 기능.
여기 개별 H1의 subtypes의 표현 수준 (그림 1) 분석을 위해 설계 assays 집합을 설명합니다. 다양한 H1 변종의 유전자의 mRNA 발현은보다 정확한 빠르고, 그리고 북부 얼룩 분석의 대체 접근법에 비해 훨씬 적은 샘플을 필요로 매우 민감하고 정량 역방향 전사-PCR (qRT-PCR) assays의 집합에 의해 측정됩니다. 대부분의 다른 세포 mRNA 메시지와는 달리, H1 유전자의 대부분을 포함하여 대부분의 히스톤 유전자, 대한 mRNAs는 오랜 polyA 꼬리 부족하지만, 3 '번역되지 않은 지역 (UTR) 10시 줄기 루프 구조를 포함합니다. 따라서 cDNAs 대신 oligo-DT의 primers의 무작위 primers를 사용하여 역방향 전사하여 총 RNA의 준비가되어 있습니다. 각 H1의 subtypes (표 1) 특정 primers와 실시간 PCR의 assays는 개별 H1를 나눠 봤는데요의 mRNA 수준의 고도의 양적 측정을 얻기 위해 수행되는의. 가사 유전자 표현은 정상화를위한 컨트롤로 분석된다.
각 H1를 나눠 봤는데요 및 핵심 histones의 단백질의 상대적인 풍요로움은 11-13 포유 동물 세포에서 추출한 총 histones의 반대 위상 고성능 액체 크로마 토그래피 (RP-HPLC) 분석을 통해 얻어진다. HPLC 방법 및 용출 조건은 여기 마우스 H1의 subtypes의 최적 분판을주는 설명했다. HPLC 프로필을 quantifying함으로써, 우리는뿐만 아니라 세포의 nucleosome 비율 H1을 결정으로, H1 가정 내에서 개별 H1의 subtypes의 상대적 비율을 계산.
Protocol
Discussion
assays의 집합은 포유 동물 링커 히스톤 subtypes의 표현 수준의 포괄적인 분석을 가능하게 여기 제시. 적절히 설계된 qRT-PCR의 assays는 어떤 포유 동물 히스톤 H1 유전자의 RNA 메시지 중 매우 민감하고 정확한 측정을 제공합니다. 링커 히스톤 나눠 봤는데요의 유전자에 대해 qRT-PCR assays의 중요한 부분은 반대로 전사를 바탕으로 임의의 프라이머를 사용하여 cDNA의 준비입니다. 대부분의 H1 유전자를 포함?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH 교부금 GM085261와 조지아 암 연합 내외 학술 상 (YF까지)에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780 |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-018 |
| SuperScriptIII | Invitrogen | 18080-051 |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 |
| IQ SYBR Green | Bio-Rad | 170-8880 |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | AMP-D1 |
| Microseal 96-well PCR plate | Bio-Rad | MSP-9605 |
| Microseal ‘B’ Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 |
| Sucrose | Agros Organics | AC40594 |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP332 |
| Sodium chloride (NaCl) | American Bioanalytical | AB01915 |
| Sodium dihydrogen phosphate heptahydrate (NaH2PO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP-330 |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 |
| Complete Mini proteinase inhibitor cocktail tablet | Roche Applied Science | 11836153001 |
| EDTA | Sigma | E-5134 |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | American Bioanalytical | AB01620 |
| Nonidet-40 (NP-40) | American Bioanalytical | AB01425 |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 |
| Tris [hydroxymethyl aminomethane] | American Bioanalytical | AB02000 |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | VWR | VW3648-3 |
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Agros Organics | AC42330 |
| Bradford Protein Assay | Bio-Rad | 500-0001 |
| Acetonitrile | EMD | AX0145-1 |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | J.T.Baker | 9470-01 |
References
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