Análisis de Expresión de mamíferos enlazador histonas subtipos
Summary
Se describe un conjunto de ensayos para analizar los niveles de expresión de las histonas H1 enlazador. ARNm de genes H1 individuales se mide cuantitativamente por transcripción inversa aleatoria cebador basado seguido por PCR en tiempo real, mientras que la cuantificación de proteínas de las histonas H1 se logra mediante análisis por HPLC.
Abstract
Histona H1 vinculador se une a la partícula central del nucleosoma y el ADN enlazador, lo que facilita el plegamiento de la cromatina en la estructura de orden superior. H1 es esencial para el desarrollo de mamíferos 1 y regula la expresión de genes específicos in vivo 2-4. Entre las proteínas histonas altamente conservadas, la familia de las histonas H1 linker es el grupo más heterogéneo. Hay 11 subtipos H1 en los mamíferos que son regulados diferencialmente durante el desarrollo y en diferentes tipos celulares. Estos subtipos H1 H1 somáticas son: 5 (H1a-e), el reemplazo de H1 0, 4 subtipos de células germinales específicos H1, y H1X 5. La presencia de los subtipos H1 múltiples que difieren en su afinidad de unión al ADN y la capacidad de compactación de la cromatina 6.9 proporciona un nivel adicional de modulación de la función de la cromatina. Así, el análisis cuantitativo de expresión de los subtipos H1 individuales, tanto de ARNm y proteínas, es necesario para una mejor comprensión de la regulación de la mayorPara estructura de la cromatina y la función.
Aquí se describe una serie de ensayos diseñados para el análisis de los niveles de expresión de los subtipos H1 individuales (Figura 1). la expresión de mRNA de varios genes H1 variante se mide por un conjunto de alta sensibilidad y cuantitativa de la PCR con transcripción inversa (QRT-PCR), que son más rápidos, más precisos y requieren muestras y mucho menos en comparación con el enfoque alternativo de análisis de Northern blot. A diferencia de la mayoría de los otros mensajes de ARNm celulares, ARNm para genes de la mayoría de las histonas, incluyendo la mayoría de los genes H1, carecen de una larga cola poli, pero contienen una estructura tallo-bucle en la región 3 'no traducida (UTR) 10. Por lo tanto, los ADNc se preparó a partir de ARN total por transcripción inversa usando cebadores al azar en lugar de cebadores oligo-dT. En tiempo real ensayos de PCR con primers específicos para cada uno de los subtipos H1 (Tabla 1) se llevan a cabo para obtener la medición altamente cuantitativa de los niveles de mRNA de subtipo H1 personas. La expresión de los genes de limpieza se analizan como controles para la normalización.
La abundancia relativa de las proteínas de cada subtipo H1 y histonas se obtiene mediante cromatografía líquida en fase inversa de alto rendimiento (CLAR) de análisis de las histonas total extraído de células de mamífero 11-13. El método HPLC y condiciones de elución descrito aquí dan separaciones óptimas de los subtipos H1 del ratón. Al cuantificar el perfil de HPLC, se calcula la proporción relativa de los subtipos H1 H1 individuales dentro de la familia, así como determinar la relación entre nucleosoma H1 en las células.
Protocol
Discussion
El conjunto de ensayos que aquí se presenta permitir el análisis exhaustivo de los niveles de expresión de mamíferos subtipos de histonas linker. Correctamente diseñados QRT-PCR proporcionar mediciones de alta sensibilidad y precisión de los mensajes de ARN de los genes histona H1 de mamífero. La parte crítica de la QRT-PCR para los genes del subtipo enlazador histonas es la preparación de cDNA utilizando cebadores aleatorios basados en la transcripción inversa. ARNm de genes más histonas, incluyendo lo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por el NIH subvención GM085261 y un Premio de la Coalición de Georgia Cancer Académico Distinguido (a la fiebre amarilla).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780 |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-018 |
| SuperScriptIII | Invitrogen | 18080-051 |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 |
| IQ SYBR Green | Bio-Rad | 170-8880 |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | AMP-D1 |
| Microseal 96-well PCR plate | Bio-Rad | MSP-9605 |
| Microseal ‘B’ Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 |
| Sucrose | Agros Organics | AC40594 |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP332 |
| Sodium chloride (NaCl) | American Bioanalytical | AB01915 |
| Sodium dihydrogen phosphate heptahydrate (NaH2PO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP-330 |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 |
| Complete Mini proteinase inhibitor cocktail tablet | Roche Applied Science | 11836153001 |
| EDTA | Sigma | E-5134 |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | American Bioanalytical | AB01620 |
| Nonidet-40 (NP-40) | American Bioanalytical | AB01425 |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 |
| Tris [hydroxymethyl aminomethane] | American Bioanalytical | AB02000 |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | VWR | VW3648-3 |
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Agros Organics | AC42330 |
| Bradford Protein Assay | Bio-Rad | 500-0001 |
| Acetonitrile | EMD | AX0145-1 |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | J.T.Baker | 9470-01 |
References
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