تعيش خلية من خلايا التصوير تعرب عن ترحيل البروتينات Fluorescently الموسومة في مصفوفة ثلاثية الأبعاد
Summary
وقد جرت العادة على العمليات الخلوية مثل الهجرة الخلية درس على السطوح ثنائية الأبعاد ، والبلاستيك شديدة. هذا التقرير وصفا لأسلوب لتصور مباشرة توطين البروتين وتحليل ديناميات البروتين في الخلايا المهاجرة في مصفوفة أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية ثلاثي الأبعاد.
Abstract
تقليديا ، وقد تمت دراسة الهجرة الخلية على اثنين من الأبعاد أسطح بلاستيكية صلبة. ومع ذلك ، خلال العمليات البيولوجية الهامة مثل التئام الجروح ، وترميم الأنسجة ، والانبثاث السرطان ، ويجب أن تنقل من خلال خلايا الأنسجة معقدة ثلاثية الأبعاد ، خارج الخلية. إلى فهم أفضل للآليات وراء هذه العمليات البيولوجية ، فمن المهم دراسة دور كل من البروتينات المسؤولة عن قيادة خلية الهجرة. هنا ، ونحن الخطوط العريضة لبروتوكول لدراسة آليات الهجرة الخلية باستخدام خط الخلايا الظهارية (MDCK) ، وثلاثية الأبعاد ، ليفي ، البلمرة مصفوفة الذاتي باعتباره النظام النموذجي. هذه المصفوفة خارج الخلية بصريا واضحة قابلة بسهولة للدراسات التصوير الخلية الحية وأفضل يحاكي الفسيولوجية ، والبيئة ، الأنسجة الرخوة. هذا التقرير يوضح تقنية لتصور مباشرة توطين البروتين وديناميكية ، وتشوه مصفوفة ثلاثية الأبعاد المحيطة.
امتحانination توطين البروتين وديناميكية خلال العمليات الخلوية توفر الفكرة الرئيسية في وظائف البروتين. به نيون المشفرة جينيا توفر طريقة فريدة من نوعها لرصد توطين البروتين وديناميكية. باستخدام هذه التقنية ، يمكننا تحليل تراكم التحت خلوية من المفتاح ، والقوة المولدة للمكونات هيكل الخلية في الوقت الحقيقي كما المناورات الخلية من خلال المصفوفة. بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام به نيون متعددة مع أطوال موجية مختلفة ، يمكننا النظر في توطين بروتينات متعددة في وقت واحد ، مما يسمح لنا لاختبار ، على سبيل المثال ، إذا كان لديهم أدوار مختلفة من البروتينات مشابهة أو مختلفة. وعلاوة على ذلك ، يمكن كميا ديناميات بروتينات الموسومة fluorescently باستخدام الاسترداد بعد Photobleaching نيون (FRAP) التحليل. هذه المقايسات قياس البروتين التنقل وكيفية ستابلي ملزمة البروتينات هي لشبكة هيكل الخلية.
عن طريق الجمع بين الخلية الحية التصوير مع علاج من مثبطات البروتين وظيفة ،يمكننا النظر في التغييرات في الوقت الحقيقي في توزيع البروتينات ومورفولوجيا الخلايا المهاجرة. وعلاوة على ذلك ، ونحن أيضا دمج الخلايا الحية التصوير مع استخدام الجزيئات التتبع الفلورسنت المدمجة داخل المصفوفة لتصور تشوه مصفوفة أثناء الهجرة الخلية. وبالتالي ، لا يمكننا تصور كيف يمكن لخلية المهاجرة توزع القوة المولدة للبروتينات ، وحيث تبذل قوات الجر إلى المصفوفة المحيطة بها. من خلال هذه التقنيات ، يمكننا الحصول على معلومات قيمة حول دور كل من بروتينات معينة ومساهماتها في آليات الهجرة الخلية.
Protocol
Discussion
نحن هنا وصف طريقة لاستخدام التصوير الخلية الحية لدراسة آليات الهجرة الخلية في مصفوفة ثلاثية الأبعاد. نجاح هذه التقنية يعتمد على الحصول على "جيدة" معربا عن استنساخ ستابلي GFP الموسومة البروتينات. وانخفاض مستوى البروتينات GFP تتطلب التعرض الإثارة الزائدة التي التن?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور جرانت سوميدا لقراءة نقدية للمخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المحقق بيكمان جائزة الشباب (سي) ، وهي جائزة هيلمان العائلة كلية جديد (سي) ، وهو EUREKA المعاهد الوطنية للصحة ، وجامعة كاليفورنيا للسرطان جنة التنسيق البحوث.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagen, bovine, Type I | BD Biosciences | 354231 | Stock is about 3 mg/ml |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | Sigma Aldrich | 281778 | Dilute in water |
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | 340855 | Dilute in PBS |
| 1M Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
| Fluospheres polystyrene microspheres 1 µm, red fluorescence (580/605) | Invitrogen | F13083 | |
| Geneticin (G418) | Invitrogen | 11811-031 | |
| Culture media components: | |||
| DMEM | Invitrogen | 31600-034 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S115500 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Kanamycin | Invitrogen | 15160-054 | |
References
- Shih, W., Yamada, S., Myosin, . A dependent retrograde flow drives 3D cell migration. Biophys. J. 98 (8), L29-L31 (2010).
- O’Brien, L. E., Yu, W., Tang, K., Jou, T. S., Zegers, M. M., Mostov, K. E. Morphological and biochemical analysis of Rac1 in three-dimensional epithelial cell cultures. Methods Enzymol. 406, 676-691 (2006).
- Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices. Nat. Methods. 7 (12), 969-971 (2010).
- Del Alamo, J. C., Meili, R., Alonso-Latorre, B., Rodriguez-Rodriguez, J., Aliseda, A., Firtel, R. A., Lasheras, J. C. Spatio-temporal analysis of eurkaryotic cell motility by improved force cytometry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (33), 13343-13348 (2007).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).
- Phair, R. D., Misteli, T. Kinetic modeling approaches to in vivo imaging. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (12), 898-907 (2001).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. Fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
