Imagerie des cellules vivantes des cellules exprimant des protéines par fluorescence Migration-étiquetés dans une matrice tridimensionnelle

Résumé

Processus cellulaires tels que la migration des cellules ont traditionnellement été étudié sur deux dimensions, les surfaces en plastique rigide. Ce rapport décrit une technique pour visualiser directement la localisation des protéines et l'analyse de la dynamique des protéines dans les cellules de migrer dans un plus physiologiquement pertinents, en trois dimensions de la matrice.

Résumé

Traditionnellement, la migration cellulaire a été étudié sur deux dimensions, les surfaces en plastique rigide. Toutefois, au cours des processus biologiques importants tels que la cicatrisation des plaies, la régénération des tissus, et les métastases du cancer, les cellules doivent naviguer à travers complexe, en trois dimensions du tissu extracellulaire. Afin de mieux comprendre les mécanismes derrière ces processus biologiques, il est important d'examiner les rôles des protéines responsables de la conduite de migration cellulaire. Ici, nous présentons un protocole d'étudier les mécanismes de la migration cellulaire en utilisant la lignée cellulaire épithéliale (MDCK), et un en trois dimensions, fibreuse, autopolymérisant matrice comme un système modèle. Cette matrice extracellulaire est optiquement clair facilement s'adapter à des études d'imagerie des cellules vivantes et mieux imite le physiologiques, l'environnement des tissus mous. Ce rapport démontre une technique pour visualiser directement la localisation des protéines et la dynamique, et la déformation de la entourant matrice tridimensionnelle.

Exammination de la localisation des protéines et la dynamique des processus cellulaires au cours donne un aperçu de la clé dans les fonctions des protéines. Génétiquement codés étiquettes fluorescentes offrent une méthode unique pour l'observation de la localisation des protéines et de dynamique. En utilisant cette technique, nous pouvons analyser l'accumulation intracellulaire de la clé, la force génératrice de composants du cytosquelette en temps réel que les manœuvres des cellules à travers la matrice. De plus, en utilisant de multiples balises fluorescentes avec différentes longueurs d'onde, nous pouvons examiner la localisation de protéines multiples simultanément, nous permettant ainsi de tester, par exemple, si différentes protéines ont des rôles similaires ou divergents. Par ailleurs, la dynamique des protéines par fluorescence marqués peuvent être quantifiés à l'aide de récupération fluorescent après photoblanchiment (FRAP) analyse. Cette mesure de la mobilité des dosages des protéines et comment stablement lié les protéines sont sur le réseau du cytosquelette.

En combinant imagerie des cellules vivantes avec le traitement des inhibiteurs de la fonction des protéines,nous pouvons examiner en temps réel l'évolution de la répartition des protéines et la morphologie des cellules migrantes. Par ailleurs, nous aussi combiner imagerie des cellules vivantes avec l'utilisation de particules de traceur fluorescent incorporé dans la matrice pour visualiser la déformation de matrice lors de la migration cellulaire. Ainsi, nous pouvons visualiser comment une cellule migration distribue la force génératrice de protéines, et où les forces de traction sont exercées à la matrice environnante. Grâce à ces techniques, nous pouvons avoir un aperçu précieux sur les rôles des protéines spécifiques et de leurs contributions aux mécanismes de la migration cellulaire.

Protocole

1. Génération d'une lignée cellulaire stable (par exemple des cellules MDCK)

1. Cellules de la plaque à 80-90% de confluence dans un plat à p35. Ne laissez pas les cellules sous forme de 100% monocouche confluente, ce qui réduira l'efficacité de la transfection.
2. Transfecter les cellules avec le plasmide d'intérêt en utilisant Lipofectamine 2000. Optimiser les conditions de transfection utilisant le protocole du fabricant.
3. Le lendemain, le passage des cellules dans deux boîtes de Pétri p150. Le grand plat est recommandé pour permettre à l'espacement suffisant entre les colonies stables.
4. Le lendemain, changer les mé....

Discussion

Nous décrivons ici une méthode pour utiliser imagerie des cellules vivantes pour étudier les mécanismes de la migration de cellules dans une matrice tridimensionnelle. Le succès de cette technique dépend de l'obtention de "bons" clones exprimant de façon stable la GFP-tagged protéines. Le faible niveau de protéines GFP, il faudra une exposition d'excitation en excès qui compromet la santé des cellules, alors que le niveau trop élevé GFP aura des effets secondaires indésirables sur la cellule. Ainsi, le.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires
Collagène, bovins, de type I	BD Biosciences	354231	Stock est d'environ 3 mg / ml
3-aminopropyltriméthoxysilane	Sigma-Aldrich	281778	Diluer dans de l'eau
glutaraldéhyde	Sigma-Aldrich	340855	Diluer dans du PBS
Hepes 1M	Invitrogen	15630-080
Polystyrène Fluospheres microsphères 1 pm, fluorescence rouge (580/605)	Invitrogen	F13083
Généticine (G418)	Invitrogen	11811-031
Culture composantes médias:
DMEM	Invitrogen	31600-034
Sérum de veau fœtal	Atlanta Biologicals	S115500
Pénicilline / streptomycine	Invitrogen	15140-122
Kanamycine	Invitrogen	15160-054