En snabb<em> In vivo</em> Analys för att testa neuromodulatory föreningar med hjälp av Giant Fiber System (GFS) av<em> Drosophila melanogaster</em> Beskrivs. Nanoinjections i huvudet av djuret tillsammans med elektrofysiologiska inspelningar av GFS kan avslöja bioaktivitet av föreningar på nervceller och muskler.
Avsökning av föreningar för in vivo-aktivitet kan användas som ett första steg för att identifiera kandidater som kan utvecklas till farmakologisk agens 1,2. Vi utvecklat en ny nanoinjection / elektrofysiologi analys som möjliggör detektering av bioaktiva modulerande effekter av föreningar på funktionen hos en neuronal krets som medierar flyktrespons i Drosophila melanogaster 3,4. Vår analys in vivo, som använder Drosophila Giant fibersystemet (GFS, figur 1) medger screening av olika typer av föreningar, såsom små molekyler eller peptider, och kräver endast minimala mängder för att framkalla en effekt. Dessutom erbjuder Drosophila GFS ett stort antal potentiella molekylära mål på nervceller och muskler. Giant fibrer (GF) synaps elektriskt (gap junctions) och kemiskt (kolinergisk) på en perifer Synapsing interneuron (PSI) och den Tergo trochanter-Muskel neuronen (TTMn) 5 </sup>. PSI till DLMn (Dorsal längsgående muskeln neuron) anslutning beror på Dα7 nikotinacetylkolinreceptorer (nAChR) 6. Slutligen, den neuromuskulära korsningar (NMJ) av TTMn och DLMn med hopp (TTM) och muskler Flight (DLM) är glutamaterg 7-12. Här visar vi hur du ska injicera metod i nanoliter mängder av en förening, medan få elektrofysiologiska intracellulära inspelningar från Giant Fiber System 13 och hur man övervaka effekterna av föreningen på funktionen av denna krets. Vi visar specificiteten hos analysen med methyllycaconitine citrat (MLA), en nAChR-antagonist, som stör PSI till DLMn förbindelse men inte GF att TTMn anslutning eller funktionen av NMJ vid hopp eller muskler flygning.
Innan du börjar denna video är det viktigt att du noggrant titta på och bekanta dig med Jové video med titeln "Elektrofysiologiska inspelningar från Giant Fiber vägen för D. Melanogaster "från Augustin et al 7, som video presenteras här är avsedd som en expansion till denna befintliga teknik. Här använder vi elektrofysiologiska inspelningar metoden och fokus i detalj endast om tillsättning av de parade nanoinjections och övervakningsteknik.
Den nanoinjection / elektrofysiologi bioassay presenteras här möjliggör en snabb screening av föreningar i nervsystemet av bananfluga. Detta är en ny in vivo-teknik som kräver små mängder av en förening för att framkalla en effekt på en mängd olika molekylära mål i en väl karakteriserad neuronala krets. Denna metod kan användas för att testa bioaktiviteten hos olika föreningar, av okända toxiner med kommersiellt tillgängliga farmakologiska medel.
Här har vi visa…
The authors have nothing to disclose.
Vi skulle vilja tacka ledamöterna i Mari lab och Godenschwege lab, i synnerhet Aline Yonezawa, för kommentarer och hjälp med detta protokoll. Detta arbete har finansierats av det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och stroke bidrag R21NS06637 till FM och TAG, AB har finansierats av National Science Foundation Award antalet 082.925, URM: Integrativ biologi för framtida forskare.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Recording glass electrodes: borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 1.0mm OD, 0.58mm ID |
Stimulator | Grass Instruments | Model S48 | |
Amplifier | Getting Instruments Inc. | Model 5A | |
Data acquisition Software: Digidata | Molecular Devices | Model 1440A | |
Data collection software: pCLAMP | Molecular Devices | Version 10 | |
Stereomicroscope with fiber optic microscope ring illuminator | AmScope | SM-4T Model HL250-AR |
|
Dissecting scope for mounting | AmScope | SM-2TZ | |
Kite Manual Micromanipulator & Tilting Base | World Precision Instruments | Model # M3301 Kite: Model # KITE-M3-L |
|
Drosophila melanogaster Wild 10E genotype (wild type strain) | Bloomington Stock center | Stock # 3892 | |
Vertical pipette puller | David Kopf Instruments | Model 700c | |
Injection glass micropipettes: Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | Catalogue # 4878 | 1.14mm OD, 0.5mm ID |
Silicon oil | Fisher | Catalogue # S159-500 | |
Beveler | Sutter Instrument Co. | K.T. Brown Type Model # BV-10 |
|
Nanoliter2000 | World Precision Instruments | Catalogue # B203XVY | |
Blue food coloring | McCormick | N/A | Ingredients: Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1, and 0.1% Propylparaben (preservative). |
Methyllycaconitine citrate (MLA) | Tocris Bioscience | Catalogue # 1029 | |
Plastic wax sticks | Hygenic Corporation (Akron Ohio USA) |