Application de la MassSQUIRM pour des mesures quantitatives de l'activité Déméthylase Lysine
Summary
Nous présentons une méthode pour l'utilisation de la spectrométrie de masse MALDI et de la chimie méthylation réductrice pour quantifier les changements dans la méthylation de la lysine.
Abstract
Récemment, les régulateurs épigénétiques ont été découverts comme des acteurs clés dans de nombreuses maladies différentes 1-3. En conséquence, ces enzymes sont des cibles de choix pour les études de petites molécules et 4 développement des médicaments. De nombreux régulateurs épigénétiques n'ont été que récemment découvert et sont encore en train d'être classés. Parmi ces enzymes sont déméthylases lysine qui éliminent des groupes méthyle de lysines sur les histones et autres protéines. En raison de la nature de cette nouvelle classe d'enzymes, des dosages peu ont été développés pour étudier leur activité. Cela a été un barrage routier à la fois la classification et l'étude à haut débit de déméthylases histones. Actuellement, des essais déméthylase il existe très peu. Celles qui existent ont tendance à être de nature qualitative et ne peut pas simultanément discerner entre les différents états de méthylation de lysine (non, mono-, di-et tri-). La spectrométrie de masse est couramment utilisé pour déterminer l'activité déméthylase, mais de masse actuels dosages par spectrométrie de fairepas non plus si les peptides différentiellement méthylés ioniser différemment. Ionisation différentielle de peptides méthylés permet de comparer les états de méthylation difficile et certainement pas quantitative (figure 1A). Ainsi des essais disponibles ne sont pas optimisés pour l'analyse complète de l'activité déméthylase.
Nous décrivons ici une méthode appelée MassSQUIRM (masse quantification par spectrométrie isotopique utilisant méthylation réductrice) qui est basé sur la méthylation réductrice de groupes amine avec le formaldéhyde deutéré pour forcer tous les lysines être di-méthylé, ce qui les rend essentiellement les mêmes espèces chimiques et donc ioniser l' même (figure 1B). La différence chimique seulement après la méthylation réductrice est de l'hydrogène et de deutérium, qui n'affecte pas l'efficacité d'ionisation MALDI. Le dosage MassSQUIRM est spécifique pour les produits de réaction avec déméthylase lysines non, mono-ou di-méthylés. Le dosage est également applicable aux méthyltransférases lysine donnant la SAmoi produits de réaction. Ici, nous utilisons une combinaison de la chimie méthylation réductrice et spectrométrie de masse MALDI pour mesurer l'activité de LSD1, une déméthylase lysine capable d'éliminer di-et mono-méthyle, sur un substrat peptide synthétique 5. Ce test est simple et facile de les faire n'importe quel laboratoire d'avoir accès à un spectromètre de masse MALDI dans le laboratoire ou par l'intermédiaire d'une installation protéomique. L'essai a ~ 8 fois la plage dynamique et est facilement extensible à 5 format de plaque.
Protocol
Discussion
MassSQUIRM est une méthode peu coûteuse et quantitative pour l'analyse détaillée de l'activité de déméthylases lysine impliqués dans les mono-et di-méthylation. MassSQUIRM offre quantification non seulement du produit de la réaction, mais aussi pour les produits intermédiaires. Ce test peut être utilisé comme un outil puissant pour étudier le mécanisme de LSD1 et autres déméthylases histones. Il sera également utile pour classer les nombreuses enzymes nouvellement découverts déméthylase lysi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le Fonds pour l'UAMS protéomique pour le soutien par spectrométrie de masse. Le financement de ce projet a été fourni par des subventions du NIH P20RR015569, P20RR016460 et R01DA025755.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| LSD1 | BPS Biosciences | 50100 |
| H3K4me2-biotin peptide | prepared in-house | none |
| POROS R2 20 micron beads | Applied Biosystems | 1-1129-06 |
| C18 ZipTip | Millipore | ZTC18M |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 |
| acetonitrile | Fisher | A996 |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma | 85707 |
| Borane dimethylamine | Sigma | 180238 |
| isotopically heavy d2-formaldehyde | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-805-20 |
| Tris | Fisher | BP154 |
| KCl | Fisher | BP366 |
| MgCl2 | Fisher | BP214 |
| Glycerol | Fisher | G33 |
| Formic acid | Fluka | 06440 |
| Methanol | Fisher | A452 |
| Na-phosphate | Fisher | BP329 |
| SpeedVac Concentrator | Savant | DNA110 |
| MALDI-prOTOF mass spectrometer and TOFworks software | PerkinElmerSciex | none |
References
- Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. Epigenetics: a landscape takes shape. Cell. 128, 635-638 (2007).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer. Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).
- Cole, P. A. Chemical probes for histone-modifying enzymes. Nat. Chem. Biol. 4, 590-597 (2008).
- Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119, 941-953 (2004).
- Blair, L. P. MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity. Epigenetics. 6, 490-499 (2011).
- Rayment, I. Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor. Science. 261, 50-508 (1993).
- Collom, S. L., Jamakhandi, A. P., Tackett, A. J., Radominska-Pandya, A., Miller, G. P. CYP2E1 active site residues in substrate recognition sequence 5 identified by photoaffinity labeling and homology modeling. Arch. Biochem. Biophys. 459, 59-69 (2007).
- Gradolatto, A. Saccharomyces cerevisiae Yta7 Regulates Histone Gene Expression. Génétique. 179, 291-304 (2008).
- Taverna, S. D. Yng1 PHD finger binding to histone H3 trimethylated at lysine 4 promotes NuA3 HAT activity at Lysine 14 of H3 and transcripiton at a subset of targeted ORFs. Mol. Cell. 24, 785-796 (2006).
