Применение MassSQUIRM для количественного измерения Лизин активность деметилазы
Summary
Мы представляем способ использования MALDI масс-спектрометрии и восстановительной химии метилирования количественного изменения в лизин метилирования.
Abstract
В последнее время эпигенетические регуляторы были обнаружены играть ключевую роль в самых различных заболеваний 1-3. В результате, эти ферменты являются главными целями для небольших исследований молекулы и 4 разработки лекарственных препаратов. Многие эпигенетические регуляторы только недавно были обнаружены и до сих пор в процессе классификации. Среди этих ферментов лизин деметилаз которые удаляют из метильных групп лизина на гистонов и других белков. В связи с новым характером этого класса ферментов, несколько анализов были разработаны с целью изучения их деятельности. Это был дорогой блок как классификация и высокой пропускной способностью исследования гистонов деметилаз. В настоящее время очень мало тестов деметилазы существует. Те, которые действительно существуют, как правило, качественный характер и не может одновременно различать между различными государствами метилирование лизина (не-, моно-, ди-и три-). Масс-спектрометрия широко используется для определения деметилазы деятельности, но текущий масс-спектрометрических анализов делатьне затрагивает ли дифференциально метилированные пептидов ионизируют по-разному. Дифференциальная ионизации метилированных пептидов делает сравнение метилирования государства трудно и, конечно, не количественный (рис. 1А). Таким образом, доступные анализы не были оптимизированы для всестороннего анализа деметилазы деятельности.
Здесь мы опишем метод MassSQUIRM (масс-спектрометрического количественного использовании изотопных восстановительного метилирования), который основан на редуктивных метилирование аминогрупп с дейтерированных формальдегид, чтобы заставить всех лизинов быть ди-метиловым, что делает их по существу и того же вида химической ионизации и, следовательно, же (рис. 1б). Разница лишь в химической после восстановительного метилирования водорода и дейтерия, которая не влияет на эффективность MALDI ионизации. Анализ MassSQUIRM является специфическим для деметилазы продуктов реакции с не-, моно-или ди-метилированных лизина. Анализ также применим к лизин метилтрансферазы давая SAМеня продуктов реакции. Здесь мы используем сочетание восстановительной химии метилирования и MALDI масс-спектрометрии для измерения активности LSD1, лизин деметилазы способен удалять ди-и моно-метильных групп, на синтетической подложке пептид 5. Этот тест является простым и легко поддаются любой лаборатории, имеющие доступ к спектрометр MALDI масс в лаборатории или через средства протеомики. Анализ имеет ~ 8-кратный динамический диапазон и легко масштабируемой, чтобы пластины формата 5.
Protocol
Discussion
MassSQUIRM является недорогим и количественных методов для всестороннего анализа деятельности лизин деметилаз участие в моно-и ди-метилирования. MassSQUIRM предлагает количественного не только продукт реакции, но и для промежуточных. Этот анализ может быть использован как мощный инструмент в …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим фонд UAMS протеомики для масс-спектрометрического поддержки. Финансирование этого проекта было предоставлено грантов NIH P20RR015569, P20RR016460 и R01DA025755.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| LSD1 | BPS Biosciences | 50100 |
| H3K4me2-biotin peptide | prepared in-house | none |
| POROS R2 20 micron beads | Applied Biosystems | 1-1129-06 |
| C18 ZipTip | Millipore | ZTC18M |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 |
| acetonitrile | Fisher | A996 |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma | 85707 |
| Borane dimethylamine | Sigma | 180238 |
| isotopically heavy d2-formaldehyde | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-805-20 |
| Tris | Fisher | BP154 |
| KCl | Fisher | BP366 |
| MgCl2 | Fisher | BP214 |
| Glycerol | Fisher | G33 |
| Formic acid | Fluka | 06440 |
| Methanol | Fisher | A452 |
| Na-phosphate | Fisher | BP329 |
| SpeedVac Concentrator | Savant | DNA110 |
| MALDI-prOTOF mass spectrometer and TOFworks software | PerkinElmerSciex | none |
References
- Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. Epigenetics: a landscape takes shape. Cell. 128, 635-638 (2007).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer. Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).
- Cole, P. A. Chemical probes for histone-modifying enzymes. Nat. Chem. Biol. 4, 590-597 (2008).
- Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119, 941-953 (2004).
- Blair, L. P. MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity. Epigenetics. 6, 490-499 (2011).
- Rayment, I. Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor. Science. 261, 50-508 (1993).
- Collom, S. L., Jamakhandi, A. P., Tackett, A. J., Radominska-Pandya, A., Miller, G. P. CYP2E1 active site residues in substrate recognition sequence 5 identified by photoaffinity labeling and homology modeling. Arch. Biochem. Biophys. 459, 59-69 (2007).
- Gradolatto, A. Saccharomyces cerevisiae Yta7 Regulates Histone Gene Expression. Génétique. 179, 291-304 (2008).
- Taverna, S. D. Yng1 PHD finger binding to histone H3 trimethylated at lysine 4 promotes NuA3 HAT activity at Lysine 14 of H3 and transcripiton at a subset of targeted ORFs. Mol. Cell. 24, 785-796 (2006).
