Aplicación de MassSQUIRM para mediciones cuantitativas de la actividad desmetilasa Lisina
Summary
Se presenta un método para el uso de espectrometría de masas MALDI y la química de la metilación reductiva para cuantificar los cambios en la metilación de la lisina.
Abstract
Recientemente, los reguladores epigenéticos se han descubierto como actores clave en muchas enfermedades diferentes 1-3. Como resultado, estas enzimas son los principales objetivos para los estudios de moléculas pequeñas y 4 desarrollo de fármacos. Muchos reguladores epigenéticos sólo recientemente se han descubierto y todavía están en proceso de ser clasificados. Entre estas enzimas son desmetilasas lisina que eliminan los grupos metilo de lisinas de las histonas y otras proteínas. Debido a la naturaleza novedosa de esta clase de enzimas, ensayos de pocos se han desarrollado para estudiar su actividad. Este ha sido un obstáculo en el camino tanto para la clasificación y el estudio de alto rendimiento de desmetilasas histonas. Actualmente, los ensayos desmetilasa existen muy pocos. Las que existen tienden a ser de naturaleza cualitativa y no se puede al mismo tiempo discernir entre los estados de metilación de lisina diferentes (un-, mono-, di-y tri-). La espectrometría de masas se utiliza comúnmente para determinar la actividad desmetilasa pero los ensayos actuales de espectrometría de masasno abordar si péptidos diferencialmente metilado ionizar diferente. Ionización diferencial de péptidos metilado hace comparando los estados de metilación difícil y ciertamente no cuantitativa (Figura 1A). Así, los ensayos disponibles no están optimizados para el análisis integral de la actividad desmetilasa.
Aquí se describe un método llamado MassSQUIRM (cuantificación de espectrometría de masas utilizando metilación reductiva isotópica) que se basa en la metilación reductiva de grupos amina con formaldehído deuterado para forzar a todos lisinas ser di-metilado, lo que les hace esencialmente las mismas especies químicas y por lo tanto ionizar el misma (Figura 1B). La única diferencia química después de la metilación reductiva es hidrógeno y deuterio, que no afecta a la eficiencia de ionización MALDI. El ensayo MassSQUIRM es específico para los productos de reacción con desmetilasa lisinas un-, mono-o di-metilados. El ensayo es también aplicable a metiltransferasas lisina dando el saMe productos de reacción. Aquí, se utiliza una combinación de la química metilación reductiva y espectrometría de masa MALDI para medir la actividad de LSD1, un desmetilasa lisina capaz de eliminar di y mono-metil grupos, en un sustrato peptídico sintético 5. Este ensayo es simple y fácilmente susceptibles a cualquier laboratorio con el acceso a un espectrómetro de masas MALDI en el laboratorio oa través de una instalación de la proteómica. El ensayo tiene ~ 8 veces el rango dinámico y es fácilmente escalable para formato de placa 5.
Protocol
Discussion
MassSQUIRM es un método económico y cuantitativo para el análisis integral de la actividad de la lisina desmetilasas involucrados en mono-y di-metilación. MassSQUIRM ofrece cuantificación no sólo del producto de la reacción, sino también para los productos intermedios. Este ensayo se puede utilizar como una poderosa herramienta en el estudio del mecanismo de desmetilasas histonas LSD1 y otros. También será útil para la clasificación de muchos recién descubiertos enzimas desmetilasa lisina como PHF8 y podrí…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias al Fondo para UAMS Proteómica para el apoyo de espectrometría de masas. Los fondos para este proyecto fue proporcionado por el NIH subvenciones P20RR015569, P20RR016460 y R01DA025755.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| LSD1 | BPS Biosciences | 50100 |
| H3K4me2-biotin peptide | prepared in-house | none |
| POROS R2 20 micron beads | Applied Biosystems | 1-1129-06 |
| C18 ZipTip | Millipore | ZTC18M |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 |
| acetonitrile | Fisher | A996 |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma | 85707 |
| Borane dimethylamine | Sigma | 180238 |
| isotopically heavy d2-formaldehyde | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-805-20 |
| Tris | Fisher | BP154 |
| KCl | Fisher | BP366 |
| MgCl2 | Fisher | BP214 |
| Glycerol | Fisher | G33 |
| Formic acid | Fluka | 06440 |
| Methanol | Fisher | A452 |
| Na-phosphate | Fisher | BP329 |
| SpeedVac Concentrator | Savant | DNA110 |
| MALDI-prOTOF mass spectrometer and TOFworks software | PerkinElmerSciex | none |
References
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