Dans ce rapport, nous décrivons une méthode pour écraser la souris nerf sciatique. Cette méthode utilise facilement disponibles pinces hémostatiques et facilement et de façon reproductible produit complet écrasement du nerf sciatique. En outre, nous décrivons une méthode pour préparer montures de muscles entiers appropriés pour l'analyse de la régénération nerveuse après écrasement du nerf sciatique.
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Article de méthode
Reproductible écrasement du nerf sciatique de souris et l'évaluation subséquente de la régénération par l'analyse du Mont muscle entier
Dans cet article
Résumé
Résumé
La régénération dans le système nerveux périphérique (SNP) est largement étudié à la fois pour sa pertinence à la maladie humaine et de comprendre la réponse robuste régénérative montée par les neurones du SNP ce qui pourrait éclairant les échecs de la régénération du SNC 1. Écrasement du nerf sciatique (axonotmésis) est l'un des modèles les plus courants de lésion du nerf périphérique chez les rongeurs 2. Broyage interrompt tous les axones, mais lames de cellules de Schwann basale sont conservés afin que la régénération est optimal 3,4. Cela permet à l'enquêteur d'étudier précisément la capacité d'un axone en croissance pour interagir avec la cellule de Schwann et lames basales 4. Les rats ont généralement été les modèles animaux préférés pour écrasement du nerf expérimentale. Ils sont largement disponibles et leur sang-froid lésé sciatique fournit une approximation raisonnable de lésions nerveuses humaines 5,4. Bien que plus petit en taille que chez le rat nerf, le nerf de la souris a de nombreuses qualités similaires. Mais surtout, énormemodèles électroniques sont de plus en plus précieux en raison de la grande disponibilité de lignées transgéniques permet maintenant une dissection détaillée des molécules individuelles critiques pour la régénération du nerf 6, 7. Enquêteurs antérieures ont utilisé de multiples méthodes pour produire un écrasement du nerf ou d'une blessure, y compris de simples pinces angulaires, pinces, pinces hémostatiques réfrigérés, pinces vasculaires, et les colliers enquêteur conçus 8,9,10,11,12. Les enquêteurs ont également utilisé diverses méthodes de marquage du site, y compris des blessures de suture, des particules de carbone et de billes fluorescentes 13,14,1. Nous décrivons notre méthode pour obtenir un écrasement du nerf sciatique reproductible complète des informations exactes et persistante de marquage de l'écrasement site à l'aide d'une pince fine hémostatiques et de carbone suite à l'écrasement du site de marquage. Dans le cadre de notre description de la procédure écrasement du nerf sciatique, nous avons également inclus une méthode relativement simple de l'ensemble des muscles que nous utilisons pour monter ensuite de quantifier la régénération.
Protocole
1. Expérimentation animale
1,1. Traitement
- Toutes les procédures d'animaux doit être effectué avec l'approbation de protection des animaux de l'institution locale et Comité d'éthique et conformément à l'utilisation et du Comité et les National Institutes of Health des lignes directrices, avec les mesures prises pour minimiser la douleur et l'inconfort.
- Nos souris ont été logés dans des conditions contrôlées de température sur un feu de recul de 12 heures et le cycle de sombre, alors que la souris nourries chow et l'eau ad libitum.
- Pour les études de régénération des adultes, les sour....
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Discussion
Nous avons présenté une méthode pour obtenir un écrasement du nerf sciatique avec fiabilité complète marquage précis du site d'écrasement. Tel que mentionné précédemment, écrasement du nerf sciatique est un modèle commun de lésion du nerf périphérique chez la souris et les rats. Bien que chaque méthode d'écrasement a ses avantages et ses inconvénients, nous avons trouvé cette méthode produit un écrasement complet qui a été facile de marquer avec un minimum d'équipements spéciaux (p.ex. pinces spéciales, etc........
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Déclarations de divulgation
Nous n'avons rien à communiquer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le NIH subventions K08NS065157 (à TAF) En outre, le Centre de Penn pour les troubles musculo-squelettiques, P30AR050950 Nombre Prix de l'Institut national de l'arthrite, les maladies musculo-squelettiques et la peau ont soutenu ce travail (TAF et Steven S. Scherer). Enfin, les Shriners de financement pédiatrique semences Research Center (TAF) a soutenu ce travail. Nous tenons à remercier le Dr Young-Jin Fils pour démontrer d'abord toute la montagne procédure et Amy A. Kim pour son aide dans la production des croquis de la figure 1.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom (description / quantité) | Fournisseur | Numéro de catalogue | |
| Clipper Mini n ° 0000 de la lame | Roboz | RC-5903 | |
| Hair Remover Nair (9 onces) | Eglise et Dwight Co., Inc | N / A | |
| Betadine scrub chirurgical (1 gallon) | Fisher Scientific | 19066452 | |
| Pommade ophtalmique (1 oz) | Fisher Scientific | 19082795 |
Outils chirurgicaux:
| Nom (description / quantité) | Fournisseur | Numéro de catalogue |
|---|---|---|
| FST 250 Hot stérilisateur à billes | Outils belle science | 18000-45 |
| Ciseaux Iris (11 cm de long) | Instruments de précision du monde | 500216 |
| Potts-Smith forceps (droite; 18cm; 1x2 dents) | Outils belle science | 11024-18 |
| McPherson Vannas Ciseaux (5 lames mm) | Instruments de précision du monde | 14124-G |
| Dumont # 5 - Pince Dumoxel standard Tip | Outils belle science | 11252-30 |
| Dumont # 5/45 - Pince Dumoxel standard Tip | Outils belle science | 11251-35 |
| Ultra fin (cylindrique hémostatiques; surfaces intérieures lisses) | Outils belle science | 13020-12 |
| Charbon actif en poudre (500 g) | Fisher Scientific | C272-500 |
| Taille 6-0 sutures avec C-1 aiguille (stérile, de la soie, noir, tressé,Non-absorbable; 18 "Longueur; Boîte de 36) | Roboz | SUT-1073-1011 |
| Applicateur de clips Reflex (pour 9 clips mm) | Instruments de précision du monde | 500345 |
| 9mm en acier inoxydable Clips Reflex (100/boîte) | Instruments de précision du monde | 500346 |
Protection des animaux:
| Nom (description / quantité) | Fournisseur | Numéro de catalogue |
|---|---|---|
| Injectable à 0,9% de chlorure de sodium (agent de conservation; 20 ml) | Hospira | 0409-4888-20 |
| Système complet de couverture homéothermes avec sonde flexible (moyenne, 115 VAC, 60 Hz) | Harvard Apparatus | 507222F |
Platfor chirurgicalem et écarteurs:
(Acheté chez votre quincaillerie locale)
| Nom (description /) | Quantité |
|---|---|
| Plate-forme en acier inoxydable (usiné; ~ 12 "x12" x1 / 8 ") | 1 |
| Aimants bouton (Exemple: Eclipse E825) | 3 |
| Boulons en acier inoxydable (3 "long; diamètre déterminé par aimants bouton) | 3 |
| Écrous en acier inoxydable (dimensionnée pour s'adapter à Boulons) | 9 |
| Elastiques (légère tension) | 3 |
| Pins d'insectes (les deux extrémités pour former des crochets Bent) | 3 |
Semi-Minces:
| Nom (description / quantité) | Fournisseur </ Strong> | Numéro de catalogue |
|---|---|---|
| Paraformaldéhyde (1 kg) | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
| Phosphate de sodium dibasique anhydre (500 g; Utilisé pour Préparer un tampon phosphate) | Fisher Scientific | S375-500 |
| Phosphate de sodium monobasique anhydre (1 kg; Utilisé pour Préparer un tampon phosphate) | Fisher Scientific | AC38987-0010 |
| Glutaraldéhyde (50%; 10 x 10 ml) | Ted Pella, Inc | 18431 |
| Tétroxyde d'osmium (aqueuse à 4%, 10 x 10 ml) | Ted Pella, Inc | 18465 |
| Oxyde de Propylène (450 ml) | Ted Pella, Inc | 18601 |
| Embed 812 (Kit, pour les blocs durs ou de contraste d'image élevée) | Sciences Electron Microscopy | 14120 |
| Toluidine Bleu (25 g) | Ted Pella, Inc | 19451 |
Whole Préparation musculaire mont et immunohistochimie:
| Nom (description / quantité) | Fournisseur | Numéro de catalogue |
|---|---|---|
| Paraformaldéhyde (1 kg) | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
| Phosphate de sodium dibasique anhydre (500 g; Utilisé pour Préparer un tampon phosphate) | Fisher Scientific | S375-500 |
| Phosphate de sodium monobasique anhydre (1 kg; Utilisé pour Préparer un tampon phosphate) | Fisher Scientific | AC38987-0010 |
| 10% de diluant BSA / solution de blocage (200 ml) | Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc | 50-61-00 |
| Triton X-100 (100 mL) | Dot scientifique Incorporated | 9002-93-1 |
| Glycine, 98% (1 kg) | Fisher Scientific | AC12007-0010 |
| Tissue-Tek Cryo-OCT composé (Caisse de 12, 4 bouteilles oz) | Fisher Scientific | 14-373-65 |
| Sylgard DOW 170 (2 Kit lb) | Fisher Scientific | NC9492579 |
| Inoxydable Pins insectes en acier, taille 1 (100/PKG) | Outils belle science | 26001-40 |
| Tétraméthylrhodamine-A-bungarotoxine (0,5 mg) | Sigma-Aldrich | T0195-.5MG |
| Anticorps monoclonal de souris contre SMI-312 (0,1 mL) | Covance | SMI-312R |
| Anticorps monoclonal de souris contre SV2 (0,1 ml) | Des études de développement de la Banque d'hybridome (DSHB) | SV2 |
| Lapin PolyAnticorps contre clonale GAP-43 | Novus Biologicals | NB300-143 |
| Flourescein conjugué de chèvre anti-IgG de souris, sous-classe 1 Fcy spécifique | Jackson ImmunoResearch | 11 5-095-205 |
| DyLight 649 conjugué d'âne anti-IgG de lapin | Jackson ImmunoResearch | 711-495-152 |
| 4 ',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, dilactate; 10 mg) | Invitrogen | D3571 |
| Vectashield Milieu de montage (10 ml) | Vector Laboratories | H-1000 |
| Superfrost Plus Lames de microscope (blanc; Taille: 75 x 25 mm, paquet de 144) | Fisher Scientific | 12-550-15 |
| Fisherfinest Lunettes de couverture Premium (Taille: 40 x 22 mm; Pack de 1 oz.) | Fisher Scientific | 12-548-5C |
Références
- Pan, Y. A., Misgeld, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Effects of neurotoxic and neuroprotective agents on peripheral nerve regeneration assayed by time-lapse imaging in vivo. J. Neurosci. 23, 11479-11488 (2003).
- Magill, C., Tong, A., Kawamura, D., Hayashi, A., Hunter, D.
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Réimpressions et autorisations
