Microscopie intravitale de la rate: Analyse quantitative de la mobilité des parasites et la circulation sanguine
Summary
Nous montrons la méthode pour effectuer la microscopie intravitale de la rate à l'aide des parasites du paludisme transgéniques GFP et la quantification de la mobilité et la circulation sanguine du parasite au sein de cet organe.
Abstract
L'avènement de la microscopie intravitale dans des modèles expérimentaux de paludisme des rongeurs a permis des avancées majeures à la connaissance de parasite-hôte 1,2 interactions. Ainsi, l'imagerie de vivo des parasites du paludisme au cours stades pré-érythrocytaires ont révélé l'entrée active de parasites dans les ganglions lymphatiques peau 3, le développement complet du parasite dans la peau 4, et la formation d'un merosome hépatocytes dérivés pour assurer la migration et libération de mérozoïtes dans la circulation sanguine 5. Par ailleurs, le développement de parasites individuels dans les érythrocytes a été récemment documenté en utilisant l'imagerie 4D et a contesté notre point de vue actuel sur l'exportation de protéines dans le paludisme 6. Ainsi, l'imagerie intravitale a radicalement changé notre vision sur les événements clés dans le développement de Plasmodium. Malheureusement, les études sur le passage dynamique des parasites du paludisme à travers la rate, un organe majeur lymphoïdes délicieusement adapté à claire rouge infecté bcellules lood manquent en raison de contraintes techniques.
En utilisant le modèle murin de paludisme à Plasmodium yoelii de souris Balb / c, nous avons mis en imagerie intravitale de la rate et rapporté un remodelage différentiel de lui et l'adhérence des globules rouges parasités (culot globulaire) à des cellules d'origine fibroblastique barrière dans la pulpe rouge pendant l'infection par le parasite du non-létales ligne 17X P.yoelii par opposition aux infections à la ligne P.yoelii 17XL mortelle du parasite 7. Pour arriver à ces conclusions, une méthodologie spécifique en utilisant le logiciel libre ImageJ a été développé pour permettre la caractérisation de la vitesse en trois dimensions des mouvements mono-culot globulaire. Les résultats obtenus avec ce protocole permettra de déterminer le temps de vitesse, la directivité et de séjour des parasites dans la rate, tous les paramètres d'adressage adhésion in vivo. En outre, nous présentons la méthodologie pour la quantification du flux sanguin en utilisant la microscopie intravitale et l'utilisation de DIFdifférents agents colorants pour mieux comprendre la structure complexe de la microcirculation de la rate.
Déclaration d'éthique
Toutes les études animales ont été effectuées dans les installations animales de l'Université de Barcelone, en conformité avec les directives et protocoles approuvés par le comité d'éthique pour l'expérimentation animale de l'Université de Barcelone CEEA-UB (Protocole n ° DMAH: 5429). Femme souris Balb / c de 6-8 semaines d'âge ont été obtenues de Charles River Laboratories.
Protocol
Discussion
La mise en œuvre de la microscopie intravitale de la rate dans ce modèle du paludisme des rongeurs a ouvert la possibilité d'enquêter sur le passage dynamique des parasites par cet organe qui a été jusqu'à présent considéré comme une «boîte noire» en raison de considérations techniques. Ici, un effort majeur a été mis à adapter une méthode quantitative qui permet une analyse comparative des lignes parasites différents niveaux unique et de la population. Contrairement à d'autres tissus et …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes particulièrement reconnaissants à S. et V. Graewe Heussler pour la formation initiale et continue en entrée microscopie intravitale des parasites du paludisme, de J. Burns pour le don de la GFP parasites transgéniques, à A. Bosch (Unité confocale, CCIT-UB, IDIBAPS) d'assistance dans l'analyse d'image et de la quantification et à P. Astola d'assistance technique. Nous remercions Tous R. et I. Caralt pour la production vidéo. MF est un bénéficiaire d'une bourse d'études supérieures de la Généralité de Catalogne. HAP est un professeur de recherche ICREA. Le travail dans le laboratoire de HAP est financé par le Programme de la Communauté européenne septième programme-cadre (FP7/2007-2013) sous convention de subvention n ° 242095, par le privé CELLEX Foundation (Catalogne, Espagne), et par le ministère espagnol de la science et l'innovation ( SAF2009-07760).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Leica TCS-SP5 confocal microscope | Leica Microsystems, Heidelberg, Germany | TCS-SP5 Serial no. 5100000419 | |
| Ketamine (Ketolar 50 mg/ml) | Pfizer | 631028 | |
| Midazolam 15 mg/3 ml | Normon | 838193 | |
| 70,000 MW Dextran, conjugated to Texas Red | Molecular Probes | D1830 | |
| Fluorescein Isothiocyanate, isomer I (FITC) | Sigma | F7250 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H1399 | |
| Giemsa stain | Sigma | GS1 | Working solution is at 10% in distilled water |
| Super Glue-3 Loctite | Loctite | 9975-0880 |
References
- Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites–recent advances and future directions. Curr. Opin. Microbiol. 8, 407-414 (2005).
- Heussler, V., Doerig, C. In vivo imaging enters parasitology. Trends. Parasitol. 22, 192-195 (2006).
- Amino, R., Thiberge, S., Blazquez, S., Baldacci, P., Renaud, O., Shorte, S. Imaging malaria sporozoites. in the dermis of the mammalian. 2, 1705-1712 (2007).
- Gueirard, P., Tavares, J., Thiberge, S., Bernex, F., Ishino, T., Milon, G. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18640-18645 (2010).
- Sturm, A., Amino, R., van de Sand, C., Regen, T., Retzlaff, S., Rennenberg, A. Manipulation of host hepatocytes by the malaria parasite for delivery into liver sinusoids. Science. 313, 1287-1290 (2006).
- Gruring, C., Heiber, A., Kruse, F., Ungefehr, J., Gilberger, T. W., Spielmann, T. Development and host cell modifications of Plasmodium falciparum blood stages in four dimensions. Nat. Commun. 2, 165-165 (2011).
- Martin-Jaular, L., Ferrer, M., Calvo, M., Rosanas-Urgell, A., Kalko, S., Graewe, S. Strain-specific spleen remodelling in Plasmodium yoelii infections in Balb/c mice facilitates adherence and spleen macrophage-clearance escape. Cell. Microbiol. 13, 109-122 (2011).
- Linden, M. v. a. n. d. e. r., R, . A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle. Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).
- Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein. 173, 33-38 (1996).
- Dunn, K. W., Sandoval, R. M., Kelly, K. J., Dagher, P. C., Tanner, G. A., Atkinson, S. J. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 283, C905-C916 (2002).
- Zhong, Z., Petrig, B. L., Qi, X., Burns, S. A. In vivo measurement of erythrocyte velocity and retinal blood flow using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. Opt. Express. 16, 12746-12756 (2008).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Bowdler, A. J. . The complete spleen. , (2002).
- Grayson, M. H., Hotchkiss, R. S., Karl, I. E., Holtzman, M. J., Chaplin, D. D. Intravital microscopy comparing T lymphocyte trafficking to the spleen and the mesenteric lymph node. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 284, H2213-H2226 (2003).
- Khandoga, A. G., Khandoga, A., Reichel, C. A., Bihari, P., Rehberg, M., Krombach, F. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS. One. 4, 4693-4693 (2009).
- Weiss, L., Geduldig, U., Weidanz, W. Mechanisms of splenic control of murine malaria: reticular cell activation and the development of a blood-spleen barrier. Am. J. Anat. 176, 251-285 (1986).
- Swirski, F. K., Nahrendorf, M., Etzrodt, M., Wildgruber, M., Cortez-Retamozo, V., Panizzi, P. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Grayson, M. H., Chaplin, D. D., Karl, I. E., Hotchkiss, R. S. Confocal fluorescent intravital microscopy of the murine spleen. J. Immunol. Methods. 256, 55-63 (2001).
- Bajenoff, M., Glaichenhaus, N., Germain, R. N. Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone. J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).
