שיטות לימוד המורפוגנזה העצבית:<em> Ex vivo</em> RNAi electroporation בקליפת עובריים מוחין Murine
Summary
לבצע הערכה מהירה של הפונקציה של הגנים בהתפתחות קליפת המוח, אנו מתארים שיטות הקשורות<em> לשעבר vivo</em> Electroporation של פלסמידים שיתוף להביע RNA מעכבות (RNAi) ו-GFP בקליפת המוח העוברי murine. פרוטוקול זה הוא מקובל בחקר היבטים שונים של neurodevelopment כגון neurogenesis, העברה עצבית ו המורפוגנזה העצבית כולל דנדריט ו תוצאה האקסון.
Abstract
קליפת המוח מכוון את התפקודים הקוגניטיביים. מבנה זה 6 שכבות נוצרת באופן בפנים ואחת בחוץ, האחרון, שבו הנוירונים הראשונים שנולדו להישאר קרוב יותר החדר ואילו נוירונים שנולדו האחרונות להעביר בעבר הנוירונים שנולדו הראשונים לקראת פני השטח של המוח 1. בנוסף העברה עצבית 2, תהליך מפתח לתפקוד קליפת המוח הנורמלי הוא הסדרת המורפוגנזה עצבית 3. בעוד המורפוגנזה עצבי ניתן ללמוד במבחנה בתרבויות העיקריות, יש הרבה מה ללמוד מהדרך שבה תהליכים אלה מוסדרים בסביבות רקמות.
אנו מתארים טכניקות לניתוח ההגירה העצבית ו / או המורפוגנזה של פרוסות organotypic של קליפת המוח 4,6. וקטור pSilencer שונה משמש המכיל גם מקדם U6 שמניע את RNA כפולים חדים תקועים ואת קלטת ביטוי נפרד המקודד חלבון ה-GFP מונע ביה CMV האמרגן 7-9. הגישה שלנו מאפשר הערכה מהירה של ליקויים תוצאה neurite על מציאה מסוים של גנים מועמדים ונעשה בו שימוש בהצלחה המסך של הרגולטורים של תוצאה neurite 8. כי רק קבוצת משנה של תאים יביע המבנים RNAi, את פרוסות organotypic לאפשר ניתוח פסיפס של פנוטיפים פוטנציאליים. יתר על כן, כי ניתוח זה נעשה אומדן של קרוב בסביבה vivo, הוא מספק עלות נמוכה אלטרנטיבה מהירה לדור של בעלי חיים מהונדס או נוק אאוט לגנים של תפקוד קליפת המוח ידוע. לבסוף, בהשוואה בטכנולוגיה electroporation vivo, את ההצלחה של הניסויים electroporation לשעבר ב vivo אינה תלויה בפיתוח ניתוח מיומן מיומנות ניתן לבצע עם זמן אימון קצר ומיומנות.
Protocol
Discussion
שיטות אלה מעורבים electroporation vivo לשעבר של פלסמידים קידוד כפולה גדילי RNA סיכות ראש 8 והתרבות של פרוסות organotypic 4 מספקים מספר יתרונות בולטים. ראשית, שיטות אלו מאפשרים הערכה מהירה של RNAi הנגזרות פנוטיפים. הכללתו של ה-GFP קלטת קידוד ביטוי וקטור pSilencer אותו המכיל מק?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד"ר שירין Bonni למתן pSil-GFP מבנה, ד"ר אלפר Uzun להמחשה של איור 1, ואת מתקן bioimaging לדוק עבור מיקרוסקופיה confocal. EMM נתמך על ידי פרס קריירה למדע רפואי Wellcome בורוז קרן, פרס חוקרים NARSAD יאנג, ו-NIH NCRR COBRE RR018728 P20-01. SBL נתמך על ידי NIH NCRR COBRE RR018728 P20-01, וקיבל תמיכה PHS NRSA 5T32MH019118-20.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Hamilton syringe | HAMILTON | 80008 | 31 gauge, 0.5 inches long,PT-4 (level of point beveling), 10μl volume |
| Platinum tweezertrodes | BTX | 45-0489 | 5mm size |
| ECM830 electroporator | BTX | 45-0002 | |
| BTX Footswitch | BTX | 45-0208 | For use with ECM830 electroporator |
| Vibrating blade microtome | LEICA | VT1000 S | |
| 6- well dish to use with inserts | FALCON | 353502 | Contains notches to fit inserts |
| Tissue culture inserts | FALCON | 353090 | 0.4 micrometer |
| Fast Green | SIGMA | F7252 | |
| Low Melting Agarose | FISHER | BP165-25 | DNA grade |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P5899 | |
| Basal Medium Eagle | Sigma Aldrich | B-1522 | |
| HBSS 10x without Ca and Mg | GIBCO | 14180-046 | |
| HEPES-free acid | Sigma- Aldrich | H4034 |
References
- Angevine, J. B., Sidman, R. L. Autoradiographic study of cell migration during histogenesis of cerebral cortex in the mouse. Nature. 192, 766-766 (1961).
- Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-392 (2004).
- Barnes, A. P., Polleux, F. Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons. Annu. Rev. Neurosci. 32, 347-347 (2009).
- Haydar, T. F., Bambrick, L. L., Krueger, B. K., Rakic, P. Organotypic slice cultures for analysis of proliferation, cell death, and migration in the embryonic neocortex. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 425-425 (1999).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal. Sci. STKE. 2002, pl9-pl9 (2002).
- Guerrier, S. The F-BAR domain of srGAP2 induces membrane protrusions required for neuronal migration and morphogenesis. Cell. 138, 990-990 (2009).
- Stegmuller, J. Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN. Neuron. 50, 389-389 (2006).
- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PLoS Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Konishi, Y. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain. Science. 303, 1026-1026 (2004).
- Vankelecom, H. Fixation and paraffin-embedding of mouse tissues for GFP visualization. Cold Spring Harb Protoc. 2009, 5298-5298 (2009).
- Hand, R. Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex. Neuron. 48, 45-45 (2005).
- Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. In Utero Electroporation as a Tool for Genetic Manipulation in Vivo to Study Psychiatric Disorders: From Genes to Circuits and Behaviors. Neuroscientist. 18, 169-179 (2012).
