Metodi per lo studio della morfogenesi neuronale:<em> Ex vivo</em> Elettroporazione RNAi in Embryonic Cerebral Cortex Murine
Summary
Per condurre una rapida valutazione della funzione dei geni nello sviluppo della corteccia cerebrale, si descrivono i metodi che comportano l'<em> Ex vivo</emElettroporazione> plasmidi di co-espressione inibitoria RNA (RNAi) e GFP in murino corteccia embrionale. Questo protocollo è suscettibile allo studio dei vari aspetti della sviluppo neurologico, quali la neurogenesi, la migrazione neuronale e la morfogenesi neuronale compresi dendrite e l'estensione assonale.
Abstract
La corteccia cerebrale dirige funzioni cognitive superiori. Questa sei struttura a strati è generata in un dentro-prima, fuori-ultimo modo, in cui i neuroni primi nati rimanere più vicino al ventricolo, mentre gli ultimi neuroni nati migrare passato i primi neuroni nati verso la superficie del cervello 1. Oltre alla migrazione neuronale 2, un processo chiave per la normale funzione corticale è la regolazione della morfogenesi neuronale 3. Mentre morfogenesi neuronale può essere studiato in vitro in colture primarie, c'è molto da imparare dal modo in cui questi processi sono regolati in ambienti tessuti.
Descriviamo le tecniche per analizzare la migrazione neuronale e / o morfogenesi in fette organotipiche della corteccia cerebrale 4,6. Un vettore pSilencer modificato viene utilizzato, che contiene sia un promotore U6 che guida l'RNA a doppio filamento tornanti e una cassetta di espressione separato che codifica la proteina GFP guidato bya CMV promoter 7-9. Il nostro approccio consente per la valutazione rapida dei difetti nella crescita dei neuriti su knockdown specifico di geni candidati ed è stato utilizzato con successo in uno schermo per i regolatori di crescita dei neuriti 8. Poiché soltanto un sottoinsieme di cellule esprimono i costrutti RNAi, le fette organotipiche permettere un'analisi mosaico dei fenotipi potenziali. Inoltre, poiché questa analisi è fatta in approssimazione nei pressi del ambiente in vivo, si fornisce un basso costo e rapida alternativa alla generazione di animali transgenici o knockout per geni di funzione sconosciuta corticale. Infine, in confronto con la tecnologia di elettroporazione in vivo, il successo di esperimenti ex vivo elettroporazione non dipende sviluppo abile capacità chirurgico e può essere eseguita con un tempo più breve di formazione e di abilità.
Protocol
Discussion
Questi metodi che comportano l'elettroporazione ex vivo di plasmidi che codificano RNA a doppio filamento tornanti 8 e cultura della organotipiche 4 fette di fornire diversi vantaggi. In primo luogo, questi metodi consentono una rapida valutazione di RNAi derivati fenotipi. L'inclusione di una codifica GFP cassetta di espressione nel vettore pSilencer stesso che contiene il promotore U6 che guida la forcina RNA a doppio filamento consente una rapida identificazione e caratter…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dott. Shirin Bonni per la fornitura del pSil-GFP costrutto, Dr. Alper Uzun per l'illustrazione della figura 1, e la struttura Bioimmagini Leduc per la microscopia confocale. EMM è sostenuta dal Premio alla Carriera per la scienza medica dalla Burroughs Wellcome Fund, un NARSAD Premio Giovani Ricercatori e NIH NCRR COBRE RR018728 P20-01. SBL è supportato dal NIH NCRR COBRE RR018728 P20-01, ed ha ricevuto il sostegno PHS NRSA 5T32MH019118-20.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Hamilton syringe | HAMILTON | 80008 | 31 gauge, 0.5 inches long,PT-4 (level of point beveling), 10μl volume |
| Platinum tweezertrodes | BTX | 45-0489 | 5mm size |
| ECM830 electroporator | BTX | 45-0002 | |
| BTX Footswitch | BTX | 45-0208 | For use with ECM830 electroporator |
| Vibrating blade microtome | LEICA | VT1000 S | |
| 6- well dish to use with inserts | FALCON | 353502 | Contains notches to fit inserts |
| Tissue culture inserts | FALCON | 353090 | 0.4 micrometer |
| Fast Green | SIGMA | F7252 | |
| Low Melting Agarose | FISHER | BP165-25 | DNA grade |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P5899 | |
| Basal Medium Eagle | Sigma Aldrich | B-1522 | |
| HBSS 10x without Ca and Mg | GIBCO | 14180-046 | |
| HEPES-free acid | Sigma- Aldrich | H4034 |
References
- Angevine, J. B., Sidman, R. L. Autoradiographic study of cell migration during histogenesis of cerebral cortex in the mouse. Nature. 192, 766-766 (1961).
- Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-392 (2004).
- Barnes, A. P., Polleux, F. Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons. Annu. Rev. Neurosci. 32, 347-347 (2009).
- Haydar, T. F., Bambrick, L. L., Krueger, B. K., Rakic, P. Organotypic slice cultures for analysis of proliferation, cell death, and migration in the embryonic neocortex. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 425-425 (1999).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal. Sci. STKE. 2002, pl9-pl9 (2002).
- Guerrier, S. The F-BAR domain of srGAP2 induces membrane protrusions required for neuronal migration and morphogenesis. Cell. 138, 990-990 (2009).
- Stegmuller, J. Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN. Neuron. 50, 389-389 (2006).
- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PLoS Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Konishi, Y. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain. Science. 303, 1026-1026 (2004).
- Vankelecom, H. Fixation and paraffin-embedding of mouse tissues for GFP visualization. Cold Spring Harb Protoc. 2009, 5298-5298 (2009).
- Hand, R. Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex. Neuron. 48, 45-45 (2005).
- Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. In Utero Electroporation as a Tool for Genetic Manipulation in Vivo to Study Psychiatric Disorders: From Genes to Circuits and Behaviors. Neuroscientist. 18, 169-179 (2012).
