幹細胞にロードされたキトサンミクロスフェアの配信のためにコラーゲンハイドロゲルの構築
Summary
現在の幹細胞治療の主要なハードルは、ホスト組織にこれらの細胞を提供するための最も効果的な方法を決定しています。ここでは、その多能性を維持するために、脂肪由来幹細胞を可能にしながら、アプローチの効率的かつ単純であるキトサンベースの配信方法について説明します。
Abstract
多能性幹細胞は再生医療1-3の分野で非常に有用であることが示されている。しかし、組織再生に効果的にこれらの細胞を使用するためには、変数の数を考慮する必要があります。これらの変数が含まれます：総体積と移植部位の表面積、組織の機械的性質および血管新生の量と細胞外マトリックスのコンポーネントが含まれています。組織の微小環境を、。宿主組織を模倣した機械的強度を維持しながら、したがって、これらの細胞を提供するために使用される材料は、定義された化学組成を持つ生体適合性でなければなりません。これらの材料はまた、酸素と栄養細胞が付着し、増殖するための有利な微小環境を提供するために透過性でなければなりません。キトサン、優れた生体適合性を有するカチオン性多糖類は、容易に化学的に修飾されたおよび in vivo Mac でと結合する高親和性を持つことができますromolecules 4-5。キトサンは、細胞接着、遊走および増殖のための基質として機能できるように、細胞外マトリックスのグリコサミノグリカン部分を模倣しています。本研究では、三次元足場6ベースのコラーゲンに脂肪由来幹細胞（ASC）を提供するミクロスフェアの形でキトサンを利用しています。理想的な細胞へのミクロス比はインキュベーション時間とロードすることができましたセルの最大数を達成するために、細胞密度を基準にして決定した。 ASCは、キトサンマイクロスフェア（CSM）に播種されると、それらはコラーゲン足場に埋め込まれており、長期間の培養で維持することができます。要約すると、この研究では、正確に三次元生体材料足場内で幹細胞を提供するメソッドを提供します。
Protocol
1。の単離脂肪由来幹細胞（ASC） 注：特に断りのない限り、すべての手順は室温で行った。 ラット腎周囲および副睾丸脂肪を分離し、前述の6、1％ウシ胎児血清（FBS）を含有する滅菌ハンクス緩衝塩溶液（HBSS）で洗浄する。 組織をミンチし、室温で8分間500グラムで50 mLのチューブと遠心分離機に1％FBSを含むHBSS 25 mLに1〜2グラムを転送…
Discussion
幹細胞ベースの治療の主要なハードルは、修理のために指定された領域への細胞の送達のための効率的な方法を開発しています。患者変動への患者の、組織の種類、損傷の大きさと深さのために、幹細胞を提供する方法論は、ケースバイケースで決定する必要があります。マトリックス内の幹細胞を埋め込み、創傷部位にそれらを提供する組織工学のための次の論理的なアプローチであるよ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DOZは、ジュネーブ財団から授与の助成金によってサポートされています。 SNは、ピッツバーグ·ティッシュエンジニアリング·イニシアティブからポストドクトラルフェローシップ·グラントによってサポートされていました。
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Hanks BalancedSalt Solution (HBSS) | Gibco | 14175 | Consumable |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Consumable |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6685 | Consumable |
| 70-μm nylon mesh filter | BD Biosciences | 352350 | Consumable |
| 100-μm nylon mesh filter | BD Biosciences | 352360 | Consumable |
| MesenPRO Growth Medium System | Invitrogen | 12746-012 | Consumable |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | Consumable |
| T75 Tissue Culture Flask | BD Biosciences | 137787 | Consumable |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448869 | Consumable |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Consumable |
| N-Octanol | Acros Organics | 150630025 | Consumable |
| Sorbitan-Mono-oleate | Sigma-Aldrich | S6760 | Consumable |
| Potassium Hydroxide | Sigma-Aldrich | P1767 | Consumable |
| Acetone | Fisher Scientific | L-4859 | Consumable |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741 | Consumable |
| Trinitro Benzenesulfonic Acid | Sigma-Aldrich | P2297 | Consumable |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Consumable |
| Ethyl Ether | Sigma-Aldrich | 472-484 | Consumable |
| 8-μm Tissue Culture Plate Inserts | BD Biosciences | 353097 | Consumable |
| 1.5-ml Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Consumable |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | Consumable |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8779 | Consumable |
| Qtracker Cell Labeling Kit (Q tracker 655) | Molecular probes | Q2502PMP | Consumable |
| Type 1 Collagen | Travigen | 3447-020-01 | Consumable |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Consumable |
| 12-Well Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353043 | Consumable |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | Equipment |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scienctific | C24 | Equipment |
| Humidified Incubator with Air-5% CO2 | Thermo Scientific | Model 370 | Equipment |
| Overhead Stirrer | IKA | Visc6000 | Equipment |
| Magnetic Stirrer | Corning | PC-210 | Equipment |
| Vacuum Desiccator | – | – | Equipment |
| Particle Size Analyzer | Malvern | STP2000 Spraytec | Equipment |
| Water Bath | Fisher Scientific | Isotemp210 | Equipment |
| Spectrophotometer | Beckman | Beckman Coulter DU800UV/Visible Spectrophotometer | Equipment |
| Vortex | Diagger | 3030a | Equipment |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Equipment |
| Light/Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | Equipment |
| Confocal Microscope | Olympus | FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope | Equipment |
| Scanning Electron Microscope | Carl Zeiss MicroImaging | Leo 435 VP | Equipment |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEOL 1230 | Equipment |
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Tags
Collagen HydrogelStem Cell-loaded Chitosan MicrospheresRegenerative MedicineImplantation SiteMechanical PropertiesVascularizationExtracellular MatrixBiocompatible MaterialsChemical CompositionMechanical StrengthPermeabilityOxygen And NutrientsChitosanCationic PolysaccharideChemical ModificationIn Vivo MacromoleculesGlycosaminoglycan PortionSubstrate For Cell AdhesionMigration And ProliferationAdipose-derived Stem Cells (ASC)Three-dimensional Scaffold
Citer Cet Article
Zamora, D. O., Natesan, S., Christy, R. J. Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres. J. Vis. Exp. (64), e3624, doi:10.3791/3624 (2012).