Enregistrement simultané des signaux calciques de neurones identifiés et le comportement alimentaire des Drosophila melanogaster</em

Résumé

La mouche des fruits, Drosophila melanogaster, S'étend sa trompe pour se nourrir, de répondre à un stimulus sucre à partir de sa trompe ou du tarse. J'ai combiné des observations de la réponse extension du proboscis (PER) avec une technique d'imagerie de calcium, ce qui nous permet de surveiller l'activité des neurones dans le cerveau, en même temps que l'observation du comportement.

Résumé

Pour étudier des réseaux neuronaux en termes de leur fonction dans le comportement, nous devons analyser la façon dont les neurones fonctionnent lorsque chaque modèle de comportement est généré. Ainsi, des enregistrements simultanés de l'activité neuronale et le comportement sont essentiels pour corréler l'activité du cerveau au comportement. Pour ces analyses comportementales, la mouche des fruits, Drosophila melanogaster, nous permet d'intégrer des indicateurs de calcium génétiquement codés tels que GCaMP ^1, pour surveiller l'activité neuronale, et d'utiliser les manipulations génétiques sophistiquées pour les techniques de optogénétique ou thermogénétique pour activer spécifiquement identifié les neurones ^2-5. Utilisation d'une technique thermogénétique nous a amené à trouver des neurones critiques pour le comportement alimentaire (Flood et al., En cours de révision). Comme une partie principale du comportement alimentaire, un adulte chez la drosophile s'étend sa trompe pour alimenter ⁶ (réponse extension du proboscis; PER), répondant à un stimulus doux à partir de cellules sensorielles sur sa trompe ou tarses. Combining le protocole de PER ⁷ avec une technique d'imagerie de calcium ^{8 à l'aide} GCaMP3.0 ^{1, 9,} j'ai mis en place un système expérimental, où l'on peut surveiller l'activité des neurones dans le centre d'alimentation - le ganglion oesophagien (SOG), simultanément avec l'observation du comportement de la trompe. J'ai conçu un appareil ("Fly cerveau en direct d'imagerie et d'électrophysiologie du stade": "LES MOUCHES") pour accueillir un adulte chez la drosophile, ce qui permet sa trompe pour se déplacer librement alors que son cerveau est exposé à la salle de bain pour le Ca ^{2 +} imagerie à travers une lentille immersion dans l'eau . Les MOUCHES convient également pour de nombreux types d'expériences en direct sur le cerveau mouche telles que l'enregistrement électrophysiologiques ou d'imagerie laps de temps de la morphologie synaptique. Parce que les résultats de l'imagerie en direct peut être directement corrélée avec le comportement simultanée PAR, cette méthodologie peut fournir un excellent système expérimental pour étudier traitement de l'information des réseaux de neurones, et comment cela cactivité ellular processus est couplé à la mémoire et en plastique.

Protocole

1. Construire les MOUCHES

1. Façonner une plate-forme du couvercle de 35 mm Falcon plat par fusion de la paroi latérale et découper pour former un angle approprié et l'épaisseur (figure 1a; figure 2). Percez un trou dans la plate-forme d'accepter la tête à la mouche (Figure 1a, b), de telle sorte que les pièces buccales sont librement exposée à l'extérieur de la chambre (Figure 1a). Coupez l'extrémité d'une pointe de Pipetman, avec la taille correspondant à la volée pour être observée. Collez le bout de la plate-forme comme le montre la figure 1a pour compléter des mouches (Figure 2).

2. Préparation de la mouche pour l'observation

1. Mourir de faim une mouche adulte pendant 24 heures à 25 ° C avant l'expérience en la plaçant dans un flacon avec seulement une serviette en papier humide, si la famine est nécessaire.
2. Anesthésier la volée en le plaçant dans un tube en plastique 15ml debout sur la glace.
3. En utilisant le forceps, insérez une mouche dans la chambre de l'MOUCHES, et poussez doucement la volée jusqu'à ce qu'elle soit incapable de se déplacer. Ensuite, insérez un bouchon pour conserver la volée. (Figure 1a, b).
4. Sceller les parties environnantes de la trompe proximale (rostre) vers le bord interne du trou; Appliquez une petite quantité de la lumière La colle (Tetric EvoFlow) sur les côtés et au-dessus de la tribune de l'extérieur (flèches dans la figure 3). Appliquer la colle également de l'intérieur des MOUCHES à l'espace entre la partie dorsale de la tête et le bord intérieur du trou (figure 1b). Afin de permettre à la tribune pour se déplacer librement, les soins devraient être prises pour empêcher la colle de toucher la tribune à l'aide d'un cil (ou quelque chose de comparable) pour étendre la colle. Enfin, durcir la colle avec le plus faible éclairement de la lumière bleue suffisante pour guérir pour éviter d'endommager la mouche de la chaleur excessive. Retirez le bouchon.
5. Un fil de tenir la tribune partiellement levé (flèche dans la figure 3) peuvent être utilisés pour stabiliser la volée »la tête s en évitant la bosse de la partie du pharynx à la SOG et d'exposer la partie ventrale de la SOG, en particulier pour les terminaux d'imagerie pré-synaptiques de neurones Gr5a ^8, qui sont couverts par une partie du pharynx lors de la trompe est complètement rétractée.
6. Remplir la surface de la plate-forme avec un sucre contenant une solution saline sans (en mM): NaCl, 140; KCl, 2; MgCl _2, 4,5; CaCl _2, 1,5, et HEPES-NaOH, 5 avec un pH de 7,1 ^10. Cette solution saline sans sucrose a tonicité semblables à celles de couramment utilisé saccharose-salines contenant comme HL3.1 ^11.
7. Ouvrir la capsule tête à l'aide d'une lame de tungstène et une pince avec des conseils affûtés comme des ciseaux, ce qui est un dispositif sur mesure et conçu à l'origine par le Dr Kageyuki Yamaoka, le Japon, pour couper la cuticule et de la trachée afin d'exposer la SOG (Figure 4). Le bord ventral de la cuticule tête a été coupée comme ventrale que possible alors que la coupe bord dorsal n'était pas aussi critique. Tout d'abord, faire une incision à travers laarête postérieure en utilisant une lame de tungstène. Ensuite, couper à travers le côté et les bords antérieurs utilisant des pinces acérées. La pièce cuticule coupe devraient être levées avec la pince et retiré. Nerfs Antennes et antennes doivent être coupés par des pinces acérées.
8. Afin d'éviter des artefacts de mouvement pendant les enregistrements, le cerveau doit être stabilisée grâce à la suppression de certaines parties de la mouche. Tout d'abord, éliminer sélectivement des sacs d'air entre le SOG et les cuticules. Coupez l'œsophage à la fin vers le pharynx et à la fin va dans la SOG pour supprimer la connexion entre le pharynx et le cerveau. Tirez ensuite Muscle 16 ^12, et enfin, détachez tout trachée reliant le cerveau et la cuticule.
9. Nous avons mis nos mouches sur la scène d'un microscope Olympus BX51WI connecté à un système de microscope confocal disque en rotation (Improvision dans PerkinElmer) (Figure 5). Une lentille immersion dans l'eau, par exemple 40X/0.8 NA, a été immergé dans le bain (figure 6 ).

3. Ca ^{2 +} l'imagerie du cerveau

1. Ca ^{2 +} imagerie utilisant GCaMP3.0 ^{1, 9} a été réalisée par le procédé mis en place par Marella et al. ⁸ (figure 6). En utilisant un microscope confocal disque en rotation (Improvision), prenez une seule section optique à 4Hz avec un temps d'exposition de 122ms en utilisant 491nm laser d'excitation, se concentrant dans la région d'intérêt (un corps cellulaire d'un neurone moteur, ou un interneurone, ou terminaisons présynaptiques des neurones sensoriels gustatifs) avec le logiciel Velocity, v. 4.3 (Improvision).

4. Stimuler les Proboscis

1. Aspirer une solution de saccharose à 100 mM aqueuse dans une aiguille hypodermique avec une mèche de petite taille (fabriqués à partir de washi papier Japon, tableau de réactifs spécifiques) faisant saillie de la pointe (figure 7).
2. Décharge d'une petite goutte de solution de saccharose sur la mèche, puis, l'aspirer, immédiatement before l'application de la mèche de papier imbibée Washi à la pointe de la trompe. La mèche de papier Washi devrait être appliquée que pour un instant afin d'éviter la satiété (figure 8). Surveiller la réponse extension du proboscis (PER) comportement en utilisant une caméra CCD attaché à un microscope à dissection (figure 5) simultanément avec le Ca ^{2 +} imagerie. Les données doivent être prises dans l'heure après le début de la dissection, car la réponse PER n'est pas maintenue plus d'une heure dans ces conditions.

5. Les résultats représentatifs

Les neurones moteurs de la tribune rapporteur, une paire de muscles principaux responsables de la levée de la tribune pour extension du proboscis, ont été signalés à montrer des réponses robustes à des stimuli sucrés ^13. Montre la figure 9 Ca ^{2 +} par le biais de signaux GCaMP3.0 ^{1, 9} exprimé par un Ga 4, pilote, E49 ^13, à partir d'un corps cellulaire du neurone moteur. Comme le montre la vidéo, un Robur PAR a été observée en synchronisme avec une augmentation de Ca ^{2 +} du signal.

Figure 1. Schéma de la mouche du cerveau en direct d'imagerie et d'électrophysiologie étape (mouches). une, les mouches est construit de telle sorte que l'angle de la paroi permet la tête mouche à sortir droite. Trois segments de la trompe mouche sont codés par couleur; la tribune est le magenta. La mouche est inséré dans la chambre avec une pince, et une découpe de l'extrémité d'une pointe Pipetman est branché à l'arrière de la chambre pour bloquer la volée de s'échapper. B, Le trou est percé afin de se conformer à la tête de la mouche. Les lacunes qui subsistent sont scellés avec de la lumière La colle comme indiqué pour s'assurer qu'il n'y a pas de fuites. Une fois la colle durcie, la pointe Pipetman comme un bouchon est enlevé. Saline est versé dans les MOUCHES telles que la surface du cerveau est complètement recouverte. Il devrait être assuré qu'il n'y a pas de fuite une solution salinetution de sur l'extrémité antérieure de la tête à la mouche. La zone ombragée par la ligne pointillée dans le panneau b montre la pièce à être disséqués.

Figure 2. Photographie des MOUCHES. La paroi en forme de croissant de colle (à partir d'un pistolet à colle) est réalisé pour commander l'écoulement de solution saline pendant la perfusion, et pour réduire la quantité de solution saline utilisé.

Figure 3. Vue frontale d'une mouche montée dans les MOUCHES. Cette image montre comment une mouche se trouve dans les MOUCHES, et comment la colle photopolymérisable est appliquée autour de la tête de la mouche (flèches) pour créer un joint de solution saline preuve. Si des fuites salines par les proboscis de la mouche, puis l'expérience va échouer. Le fil (flèches) attaché à l'étape a pour maintenir la trompe en position, de sorte qu'il n'est pas complètement rétraction Ted. Sinon, il risque d'entraver la partie la plus ventrale du SOG et causer des artefacts de mouvement.

Figure 4. Haut-tenu des mouches avec une mouche disséquée. Cette image montre l'exposé d'un SOG enlever les cuticules volée suivante. L'œsophage, Muscle 16 et trachées relié au cerveau, ainsi que certains de l'air des sacs ont également été supprimés pour les empêcher de perturber le cerveau, qui peut conduire à des artefacts dans les signaux calciques.

Figure 5. Appareil de surveillance. Ce dispositif est assemblé à partir d'un microscope Olympus BX51WI attaché à un système de microscope confocal disque tournant (Improvision), et un montage latéral Nikon SMZ800 microscope. Cette configuration permet l'imagerie en direct de l'activité cérébrale durant PAR comportement.

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Figure 6. Des photographies pour montrer le côté-vue des mouches. La fine couche de solution saline est pris en sandwich entre le 40X immersion dans l'eau la lentille et la volée.

Figure 7. Schéma pour la fabrication de la mèche de papier Washi. Gampi-papier washi est un parchemin traditionnel japonais qui est extrêmement mince et lisse (Haibara, Japon). Il est également très forte et peut conserver une grande quantité de liquide. Le papier Washi doit être coupée en un trapèze avec des dimensions très spécifiques; 0,3 mm et 0,7 mm de largeur, et 4-5 mm de longueur (a). Ce trapèze est ensuite inséré depuis le côté 0,7 mm dans la pointe d'une aiguille hypodermique 23 U et peut également être stabilisé par l'insertion d'une broche d'insecte, qui est courbée à une forme en V (b). C, Le papier Washi devient transparente après l'expositionà un liquide, le rendant idéal pour cette expérience.

Figure 8. Stimulation de la trompe sur les mouches avec du washi-mèche. La mèche de papier Washi à la pointe d'une aiguille hypodermique est appliqué pour un instant à l'aide d'un manipulateur Joystick avec une seule main. L'aiguille est reliée à travers un tube flexible à manipuler avec un injecteur d'autre part, pour aspirer et décharger une solution de saccharose.

Figure 9. Des résultats représentatifs. A, par le comportement enregistré par la caméra CCD installée sur le stéréomicroscope. Vue frontale de la mouche affamée avec une trompe étendues (flèches) avant la stimulation, à la stimulation, et après la stimulation d'une mèche contenant 100 mM de solution aqueuse de saccharose (flèche). Éclairement est accomplie par un laser 491 nm utilisépour GCaMP fluorescence. b, saccharose induit GCaMP 3,0 réponse dans le neurone moteur pour le rapporteur du muscle tribune de l'état famélique. Le panneau supérieur, avant la stimulation; le panneau inférieur, immédiatement après la stimulation. La barre d'échelle, 10 um. C, la quantification de la réponse induite par le saccharose-GCaMP 3.0. Le neurone moteur répond à un stimulus de saccharose par une forte augmentation de la fluorescence suivie d'une phase de restauration de plusieurs secondes à la ligne de base.

Discussion

Les MOUCHES permet l'enregistrement simultané de signaux Ca ^{2 +} et le comportement PER. Même avec le cerveau exposé à une solution saline normale comportement PAR a été observée. Utilisation de la mèche Gampi-Washi au lieu d'une mèche Kimwipe utilisé dans le method7 origine capillaire facilite un comportement hautement reproductible et stable PER et évite la nécessité d'acquérir des compétences dans la fabrication et le choix d'une mèche Kimwipe bonne. Les conseils expérimentales indiqué ci-dessus nous a permis de réussir à éviter les perturbations par le mouvement de la trompe, ce qui conduit à un enregistrement très stable de Ca ^{2 +} signaux à faible bruit. De temps en temps, de tissus n'était pas suffisant pour exposer des cellules ou supprimer le mouvement de manière adéquate, ce qui conduit à des résultats médiocres. Cependant, une fois que nous étions qualifiés, plus de 80% des préparations donné de bons résultats. Cette méthodologie n'est pas seulement pour le Ca ^{2 +} imagerie, mais peut aussi être adapté à n'importe quelle imagerie en temps réel tout en observant le comportement PAR. Par exemple, nous pouvons accéder à n'importe quelle cellule par l'intermédiaire dul'utilisation d'une électrode d'enregistrer directement l'activité. Combiné avec la microscopie à deux photons d'excitation, nous sommes en mesure de réaliser une imagerie laps de temps de la structure synaptique, qui peut être liée à des changements de comportement. Par conséquent, cette méthode de l'imagerie cérébrale à l'observation du comportement n'est pas seulement précieuse pour la dissection fonctionnelle du réseau neuronal, mais pourrait être utilisé comme un outil puissant pour corréler ¹⁴ plasticité synaptique à des mécanismes sous-jacents de la mémoire.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom de l'équipement / Réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tetric EvoFlow	Ivoclar Vivadent	M04115	Photopolymérisable colle
Microscope BX51WI	Olympe	BX51WI	Avec 40X (NA 0,8) objectif immersion dans l'eau
Spinning système de microscope confocal disque	Improvision dans PerkinElmer		Avec 491 nm laser
Stéréomicroscope	Nikon	SMZ-800	Attaché à un bras oscillant. Vue stéréo est toujours disponible avec enregistrement vidéo
Gampi-papier washi	Haibara, le Japon		Un type spécial de papier japonais traditionnel
La caméra CCD	The Imaging Source	DFK41AU02	1/2 "1080 × 960 pixels SONY CCD
Manipulateur Joystick	Narishige	MN-151
Injecteur	Narishige	IM-5B