وصفنا أسلوبا لضربة قاضية مشروط التعبير عن بروتين الهدف خلال الكبار الزرد تجديد زعنفة. هذا الأسلوب الذي ينطوي الصغيرة عن طريق الحقن وelectroporating morpholinos قليل النوكليوتيد العقاقير إلى الأنسجة الزعانف، والذي يسمح باختبار دور هذا البروتين في مراحل مختلفة من تجديد الزعانف، بما في ذلك التئام الجروح، وتشكيل مأرمة، وثمرة التجدد.
يمكن أن أنواع معينة من urodeles والأسماك مكتملة العظام تجديد أنسجتها. وأصبحت نموذجا الزرد المستخدمة على نطاق واسع لدراسة تجديد التلقائي للأنسجة البالغين، مثل القلب 1، شبكية العين 2، 3 الحبل الشوكي، العصب البصري 4، خلايا الشعر الحسية 5، وزعانف 6.
الزعنفة الزرد هو ملحق بسيطة نسبيا التي يتم التلاعب بها بسهولة لدراسة مراحل متعددة في تجديد تجدد المقطوع. كلاسيكيا، تميزت زعنفة تجديد من قبل ثلاث مراحل متميزة: التئام الجروح، وتشكيل مأرمة، وثمرة زعنفة. بعد بتر جزء من الزعانف، وظهارة المحيطة انتشارا ويهاجر على الجرح. في 33 درجة مئوية، وهذه العملية تحدث في غضون ست ساعات ما بعد بتر (HPA، الشكل 1B) 6،7. المقبل، والخلايا الكامنة من أنساب مختلفة (مثل العظام والدم والدبقية، الخلايا الليفية) إعادة إدخال دورة الخلية لتشكيل مأرمة التكاثري، ثhile البشرة المغطي تستمر في التكاثر (1D الشكل) 8. ثمرة كما يحدث الخلايا الأقرب إلى مأرمة في الأنساب كل منها إعادة التفريق، لتشكيل أنسجة جديدة (الشكل 1E) 8. تبعا لمستوى لبتر، اكتمال تجديد كامل في الاسبوع لمدة شهر.
التعبير عن عدد كبير من العائلات الجينات، بما في ذلك hox، wnt، جمعية جيل المستقبل، MSX، حمض الريتينويك، SHH، الشق، BMP، وactivin بيتا الجينات A، هو ما يصل ينظم خلال مراحل معينة من تجديد زعنفة 9-16. ومع ذلك، فقد كان دور كل من هذه الجينات والبروتينات التي ترميز خلال تجديد الصعب تقدير، ما لم يكن المانع محددة للبروتين موجود 13، متحولة حساسة للحرارة أو وجود حيوان المعدلة وراثيا (إما overexpressing البروتين من النوع البري أو المهيمنة 1 سلبية البروتين) قد ولدت 7،12. نحن develoPED تقنية عكس الوراثية بسرعة وسهولة اختبار وظيفة من أي جين خلال تجديد زعنفة.
وتستخدم على نطاق واسع [أليغنوكليوتيد] Morpholino لدراسة فقدان بروتينات معينة أثناء الزرد، القيطم والحمص، والفأر التنمية 17-19. Morpholinos basepair مع تسلسل الحمض النووي الريبي مكملة لاما الربط ما قبل مرنا كتلة أو ترجمة مرنا. ونحن تصف طريقة لإدخال بكفاءة فلوريسئين الموسومة العقاقير morpholinos في زعانف اسماك الزرد تجديد في التعبير ضربة قاضية من البروتين الهدف. وmorpholino والصغرى تحقن كل مأرمة من زعنفة الذيل تجديد الزرد وelectroporated في الخلايا المحيطة بها. فلوريسئين يوفر هذا الاتهام إلى electroporate في morpholino وتصور morpholino في الأنسجة زعنفة.
هذا البروتوكول يسمح مشروط ضربة قاضية البروتين لدراسة دور بروتينات معينة أثناء نمو زعانف التجدد. في مناقشة:ن، ونحن تصف كيفية ويمكن تكييف هذا النهج لدراسة دور بروتينات معينة أثناء التئام الجروح أو تشكيل مأرمة، فضلا عن علامة المحتملة للهجرة من خلال تشكيل خلية مأرمة.
هنا، نحن تصف قوية الخسارة من وظيفة إلى نهج البروتينات ضربة قاضية مشروط من الاهتمام خلال تجديد الزعانف في الزرد الكبار. وقد استخدمت هذه التقنية لدراسة الجينات تقاطع الفجوة، مما يشير إلى المستقبلات، عوامل النسخ، و microRNAs خلال ثمرة زعنفة التجدد 16، 20-22.
ونحن نتوقع أن هذه التقنية يمكن أيضا أن تستخدم لدراسة الجينات اللازمة لالتئام الجروح وتكوين مأرمة عن طريق تكييف هذه التقنية. على سبيل المثال، نحن وحقن electroporated 1 morpholino التحكم في المسافة بين الزعانف عظمي في النصف الظهري من الزعنفة قبل بتر (الشكل 7). نحن بتر ثم الزعنفة البعيدة على الفور إلى حقن طائرة. 24 HPA، لاحظنا أن الخلايا المستهدفة morpholino هاجروا بشكل أقصى لتشكيل كلا من ظهارة الجرح ومأرمة (الشكل 8)، مشيرا إلى أن الخلايا خلال هذه المراحل المبكرة من التجدد ويمكن أيضا أن targeted.
هذه التقنية لديها عدد قليل من القيود الملحوظة. على سبيل المثال، مضان من العلامة فلوريسئين لا تستمر تثبيت التالية وتجهيز المناعية، مما يجعل من المستحيل لربط النمط الظاهري خاص الخلوية (أي تكاثر الخلايا) مع كمية من morpholino الحالي في خلية. وبالإضافة إلى ذلك، لم نتمكن من تحقيق باستمرار electroporation من البلازميدات في تجديد زعنفة الذيل، على الرغم من أن المجموعة السابقة لم تبلغ عن electroporation ناجح من الحمض النووي في أنسجة فنلندا 23. أخيرا، لاحظنا أن morpholino فعالة فقط لمدة 48 ساعة ~ electroporation آخر القرن 21، الذي يحظر استخدام هذه التقنية في شكلها الحالي لاختبار الجينات المسؤولة عن التفريق بين أنواع الخلايا الجديدة. قد يتم إجراء اختبارات إضافية وتعديل إجراءات التغلب على هذه القيود الحالية.
وبالإضافة إلى ذلك، فمن الممكن أنه يمكن استخدام هذه التقنيةلاختبار البروتينات التي تنطوي عليها الهجرة خلية من النسيج الأساسي للمأرمة. على سبيل المثال، نحن وحقن electroporated تحكم morpholino إلى جانبي الزعنفة (كما هو موضح في الشكل 7) قبل بتر. نحن بتر ثم النصف الظهري من الزعنفة البعيدة مباشرة إلى الطائرة الحقن ونحن بتر الزعنفة البطنية أكثر من ذلك بكثير بشكل أقصى. في 24 HPA، كانت الخلايا morpholino إيجابية على الجانب الظهري هاجروا من موقع حقن لالمغطي ظهارة الجرح ومأرمة. ومع ذلك، كان هذا لا ينطبق على الجانب البطني (الشكل 9). هذا يدعم الفكرة القائلة بأن فقط الخلايا التي تكمن وراء طائرة بتر المشاركة في استجابة التجدد. هذه البيانات تشير أيضا إلى أن يمكن اختبار البروتينات افترض أن تكون هناك حاجة للهجرة الخلية باستخدام هذه التقنية.
The authors have nothing to disclose.
فإن الكتاب أود أن أشكر الحياة Freimann مركز العلوم ومركز البحوث للموظفين الزرد لرعايتهم والحفاظ على الزرد.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
CUY21-EDIT or CUY21-SC Square wave electroporator | Protech International | CUY21EDIT or CUY21SC | Both units work for this protocol |
3-mm diameter paddle electrodes | Protech International | CUY 650-P3 | |
Morpholino | GeneTools, LLC | Morpholino should be custom designed to your protein of interest | |
2-Phenoxyethanol | Sigma | 77861-1L | Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia |
Micro-injection pump | World Precision Instruments | PV830 Pneumatic PicoPump | Many different microinjection systems could be used |
Micro-manipulator | World Precision Instruments | MMJR | Right-handed (MMJL for left-handed) |
Micro-injection needles, 1.0 mm outside diameter | World Precision Instruments | 1B100F-4 | These are borosilicate glass capillaries, pulled into a needle |
Needle holder | World Precision Instruments | 5430-ALL | Pico Nozzle Kit; make sure to inset the 1.0 mm pipette gasket |
Needle puller | Sutter | P-97 | Other micropipette/needle pullers should also work |
Microscope | Leica, Nikon, Zeiss | Number varies depending on the manufacturer | Any stereomicroscope with 20X optics and the ability to work with micromanipulators |