Isolering og Udvidelse af menneskelige glioblastom multiforme tumorceller Brug af Neurosphere Assay

Summary

Denne video protokol viser isolation og udvidelse af stamceller lignende celler fra kirurgisk resektion menneskelige glioblastom mutliforme (GBM) tumor væv ved hjælp af neurosphere assay kultur metode.

Abstract

Stem-lignende celler har været isoleret i tumorer såsom bryst-, lunge-, tyktarms-, prostata og hjerne. Et kritisk punkt i alle disse tumorer, især i glioblastom mutliforme (GBM), er at identificere og isolere tumorfremkaldende cellepopulation (r) til at undersøge deres rolle i tumordannelse, progression, og gentagelse. Forståelse tumorfremkaldende cellepopulationer vil give et fingerpeg om at finde effektive behandlingsmetoder for disse tumorer. Den neurosphere assay (NSA) på grund af sin enkelhed og reproducerbarhed er blevet brugt som den foretrukne metode til isolering og opformering af mange af denne tumorceller. Denne protokol viser neurosphere kultur metode til at isolere og udvide stamceller-lignende celler i kirurgisk resektion menneskelige GBM tumor væv. Procedurerne omfatter en indledende kemisk fordøjelse og mekanisk dissociation af tumorvæv, og efterfølgende plettering den resulterende enkelt celle suspension i NSA kultur. Efter 7-10 dage, neurospheres primære af 150-200 ìm i diameter kan observeres og er klar til yderligere passaging og ekspansion.

Protocol

1. Indsamling af primær GBM Tissue En glioblastom mutliforme (GBM) tumor er opnået fra en patient diagnosticeret med kræft og skal opereres. Der skal træffes med neurokirurgi team. Den neurokirurg vil placere resekterede GBM tumor i en passende størrelse rør, der indeholder neurale stamceller (NSC) basal medium suppleret med 10-15% antibiotika (Peniciline / streptomycin). Kolde medium skal leveres til operationsstuen ved lab. Alternativt kold HEPES-buffer Minimum Essential Medium (HEM) eller fosfatbufferet saltopløsning (PBS) med høj koncentration af antibiotika kan også bruges til dette formål. Den resektion tumorvæv leveres til laboratoriet på is og placeres under kølerhjelmen. 2. Dissociation af primær tumor i encellede Suspension Overskud af det originale medie / PBS fjernes fra falk røret, og prøven er vasket 2-3 gange med 5-10ml PBS / NSC basal medium til at fjerne blod og snavs. PBS / Medium er fjernet, og GBM tumor væv er placeret i en petriskål. Vævet skæres i små stykker og hakket med en nr. 10 skalpelblad i bittesmå stykker til at øge overfladearealet for trypsinization proces. Hakning kan tage 1-3 minutter afhængigt af størrelsen af ​​tumor. Det hakkede væv er trypsinized i 3-5 ml forvarmet% 0,05 trypsin-EDTA i 10-15 minutter ved et 37 ° C vandbad. En elektronisk pipette bruges til at overføre den lille tumor stykker og trypsin i et 15 ml Falcon rør. En lige så stor mængde af sojabønner trypsin inhibitor er tilføjet for at stoppe den enzymatiske trypsin reaktion efter inkubationstiden. Trypsin inaktivering er sikret ved pipettering suspensionen op og ned flere gange. Derefter suspensionen er pelleterede nede ved centrifugering ved 800rpm (110g) i 5min. Supernatanten kasseres, og vævet stykker er resuspenderes i 1 ml sterilt NSC basal medium. De klumper der dissocieres ved forsigtigt at pipettere op og ned (3-7 gange), indtil en glat mælket enkelt celle suspension er opnået. Antallet af pipettere trin direkte afhænger af størrelsen af ​​partikler i hakket væv. Langvarig og kraftig mekanisk dissociation bør undgås, da det kan medføre celledød og en reduktion i sfære formation. For at fjerne un-opdelte stykker og snavs, er 10-15 ml af basal medium føjet til rør og cellesuspensionen er filtreret gennem et 40 mikron celle si i en 50ml tube. Den filtrerede Suspensionen centrifugeres ved 800rpm (110g) i 5min. Supernatanten kasseres bagefter. Pelletted celler bliver derefter resuspenderet i 1-2 ml af komplette NSC medium for celletælling. 3. Celletal og Belægning 10 μL af cellesuspensionen føjes til 90 μL af 0,04% Trypan blå i en 1 ml eppendorfrør. Bemærk: andre relevante celle fortyndingtioner kan også anvendes. Pipette op og ned for at blande suspensionen. 10 μL af cellerne / trypan blå blanding overføres til hemocytometer med henblik på at tælle celle tæthed. Celler er belagt i fuldstændig NSC medium (en blanding af NSC basal mellemstore og NSC spredning supplere med en 09:01-forholdet), suppleret med 20ng/ml Globaliseringsfonden, 10ng/ml bFGF og 1μl/ml på 0,2% heparin (2μg/ml) i passende vævskultur fartøjer. 5, 20 og 40 ml medium bruges til T25, T80 og T175 kolber, hhv. Antibiotika kan tilsættes til det medium i en koncentration på 1:100 for at mindske risikoen for forurening. Kolben placeres i en inkubator indstillet til 37 ° C og 5% CO 2. 4. Passaging og udvidelse af GBM afledt områder: Når neurospheres nået en gennemsnitlig størrelse på 150-200 ìm i diameter, kulturen er klar til subkultur. Indholdet af hver kolbe fjernes og anbringes i en passende størrelse steril Tissue kultur rør og centrifugeres ved 800 rpm (110 g) i 5 min ved stuetemperatur. Supernatanten fjernes, og pellet er resuspenderet i 1 ml% 0,05 trypsin-EDTA. For at opnå en optimal trypsinization, er cellesuspensionen inkuberes ved 37 ° C i et vandbad i 2-3 min. For at stoppe trypsin aktivitet en tilsvarende mængde af sojabønner trypsin inhibitor føjes til cellesuspensionen og cellesuspensionen er forsigtigt pipetterede op og ned. Cellesuspensionen centrifugeres ved 800 rpm (110g) i 5 min. Derefter er supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 1 ml NSC medium. En celletal udføres som beskrevet tidligere. Cellerne er belagt med en koncentration på 5×10 4 celler / ml i fuldstændig NSC medium suppleret med vækstfaktorer og forgyldt i passende størrelse vævskultur fartøjer som beskrevet i foregående del. Sekundære neurospheres dannes i 7-10 dage, når de inkuberes ved 37 ° C i et fugtigtficeret inkubator med 5% CO 2. 5. Repræsentative resultater: Efter plating de enkelte celler høstet fra GBM tumor væv, formere tumor stamceller-lignende celler og generere små klynger af celler består af få celler i 3-4 dage (se video og figur 1). Efterhånden som disse klynger vokser, de får en mere sfærisk form, så med 7-8 dage, korrekt fase lyse kugler med en gennemsnitlig diameter på 150-200 mikrometer form (Se videoen og figur 2). Ved højere forstørrelse, som normalt sunde kugler demonstrere microspikes på deres periferi. At have store kugle lignende klynger i 1-2 dage efter kultur indledning skyldes eksistensen af ​​en ikke-opdelte klumper på binging af den kultur og bør ikke forveksles som sande sfærer. Mængden af ​​affald i primær tumor sfære kultur varierer afhængigt af den oprindelige kilde til væv og hvorvidt det inkluderer alle omkringliggende hjernevæv. Korrekt væv forberedelse teknikkerherunder enzymatiske og mekaniske dissociation, og efterfølgende filtrering af prøven med tilstrækkelig mængde medie kan resultere i mindre affald i kultur. Figur 1. Primær GBM sfære kultur 4 dage efter plating. Tumor stamceller-lignende celler deler sig og skaber små klynger af celler i 3-4 dage. Original Forstørrelse; 20x. Figur 2. Passage en GBM sfære kultur 8 dage efter plating. Original Forstørrelse; 20x.

Discussion

At isolere neurale stamceller og stamceller fra normale voksne og føtale hjerner ^{1, 2, 3, 4} og også tumor stamceller-lignende celler fra kræft væv såsom lunger ^{5, prostata-6,} bryst ⁷ og hjerne ^{8, 9,} neurosphere analysen er blevet ofte bruges som den foretrukne metode. Ved hjælp af denne enkle og reproducerbare analyse, kan man generere et ubegrænset antal af celler fra resektion af tumorvæv, der viser samme karakteristika som somatiske stamceller; ex vivo multipotency, evnen til at skabe nye svulster på implantation, og selv-fornyelse. Disse celler kan bruges til at studere de grundlæggende kræft cellebiologi herunder celle-til-celle-interaktioner og differentiering, migration, invasion og celledød. Derudover giver isoleret tumor stamceller-lignende celler et uvurderligt værktøj til at studere, hvordan tumorer form, fremskridt og tilbagefald og også for at optrævle de underliggende følger cellulære mekanismer, der i sidste ende kan give indsigt til terapeutiskvalgmuligheder.

Materials

Name of the reagent	Type	Company	Catalogue number	Comments
NeuroCult NSC Basal Medium (Human)	Medium	Stem Cell Technologies	05750
NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human)	Medium supplement	Stem Cell Technologies	05753
%0.05 trypsin-EDTA	Reagent	Gibco	25300-062
*MEM	Reagent	Gibco	41500-018	HEM component
*HEPES	Reagent	Sigma	H4034	HEM component
*Distilled water	Reagent	Gibco	15230-147
**DNase I	Reagent	Roche	104159
**Soybean trypsin inhibitor	Reagent	Sigma	T6522
Pen/Strep	Reagent	Gibco	15140-122
No. 10 scalpel blade	Surgical tool	BD	371610
Petri Dish	Culture ware	BD Falcon	353003
Small forceps	Surgical tools	Fine Science Tools	11050-10
Cell strainer	Sieve	BD Falcon	352340
T25 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	136196
T80 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	178905
15 ml tubes	Culture ware	BD Falcon	352096
50 ml tubes	Culture ware	BD Falcon	352070
EGF	Growth factor	R&D	2028-EG
b-FGF	Growth factor	R&D	3139-FB
Heparin	Growth factor	Sigma	H4784	Reconstituted in PBS

* To make HEM, mix 1x10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.

** To prepare trypsin inhibitor solution, first make 10 ml of DNase I solution (100 mg DNase dissolved in 100 ml of HEM) and then add 0.14 g of trypsin inhibitor to DNase solution and finally make the volume up to 1 Liter using HEM. Keep aliquots of the final products in -20°C freezer.