Isolering och kultur hippocampusneuroner från Prenatal möss
Summary
Vi erbjuder ett protokoll för odling av högrenade hippocampus nervceller från prenatal mus hjärnor utan användning av en matare gliacell lager.
Abstract
Primära kulturer av rått-och mus-hippokampala neuroner används allmänt för att avslöja cellulära mekanismer i neurobiologi. Genom att isolera och växande enskilda nervceller, forskare kan analysera egenskaper som relaterade till cellulär människohandel, cellstruktur och individuell protein lokalisering med hjälp av olika biokemiska tekniker. Resultat från sådana experiment är avgörande för att testa teorier som behandlar den neurala grunden för minne och inlärning. Emellertid är entydiga resultat från dessa former av experiment baserad på förmågan att växa neuronala kulturer med minimal förorening av andra typer av hjärnceller. I detta protokoll använder vi specifika medier avsedda för neuron tillväxt och noggranna dissektion av embryonal hippocampusvävnad att optimera tillväxten av friska nervceller och samtidigt minimera kontaminerande celltyper (t.ex. astrocyter). Embryonal musen hippocampusvävnad kan vara svårare att isolera än liknande gnagare vävnaden på grund av storleken på provet för dissection. Vi visar detaljerade dissekering tekniker för hippocampus från embryonala dag 19 (E19) mus valpar. När väl hippocampusvävnad isoleras, är milda dissociation av neuronala celler som uppnås med en utspädd koncentration av trypsin och mekanisk sönderdelning utformad för att separera celler från bindväv och samtidigt tillhandahålla minimal skada på individuella celler. En detaljerad beskrivning av hur man framställer pipetter som skall användas i att upplösa ingår. Optimala plätering densiteter finns för immuno-fluorescens protokoll för att maximera framgång cellodling. Protokollet tillhandahåller en snabb (ungefär 2 h) och effektiv teknik för odling av neuronala celler från mus hippocampusvävnad.
Protocol
Discussion
Hippocampus kulturer har använts i molekylär biologi för mer än 20 år. I princip kan neuronala kulturer göras från någon del av hjärnan har hippocampus kulturer visat sig vara den mest populära på grund av den relativt enkla arkitektur nervcell befolkningen i hippocampus 7. Hippocampus kulturer vanligtvis tillverkade av sent skede embryonal vävnad. Denna vävnad är lättare att skilja och innehåller färre gliaceller än vad moget hjärnvävnad 1. Isolering av hippocampus neuroner fr?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Michael Wooten för hans hjälp att förbereda manuskriptet. Detta arbete stöddes av NIH 2RO1NS033661 (MWW).
Materials
| Name of Reagent | Vendor | Catalog Number |
| Rat Tail Collagen 1 | BD Biosciences | 354236 |
| Poly-D-lysine Solution | Chemicon | A-003-E |
| Hanks Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-095 |
| Trypsin Solution (1X) 0.25%, liquid | Invitrogen | 15050-065 |
| NeuroBasal Medium (1X) liquid | Invitrogen | 21103-049 |
| B27 Supplement (50X) liquid | Invitrogen | 17504-044 |
| L-Glutamine 200 mM (100X) liquid | Invitrogen | 25030-149 |
| Penicillin (10,000 units/ml) / Streptomycin (10,000 μg/ml) | Invitrogen | 15140-148 |
| HI-Donor Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12150H |
References
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126, 397-442 (1977).
- Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. J. Neurosci. Res. 42, 674-683 (1995).
- Brewer, G. J. Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 71, 143-155 (1997).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J. Neurosci. Res. 35, 567-576 (1993).
- Burwell, R. D., Saddoris, M. P., Bucci, D. J., Wiig, K. A. Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning. J. Neurosci. 24, 3826-3836 (2004).
- Gluck, M. A., Myers, C., Meeter, M. Cortico-hippocampal interaction and adaptive stimulus representation: a neurocomputational theory of associative learning and memory. Neural Netw. 18, 1265-1279 (2005).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Mao, L., Wang, J. Q. Gliogenesis in the striatum of the adult rat: alteration in neural progenitor population after psychostimulant exposure. Brain Res. Dev. Brain Res. 130, 41-51 (2001).
- Mao, L., Wang, J. Q. Upregulation of preprodynorphin and preproenkephalin mRNA expression by selective activation of group I metabotropic glutamate receptors in characterized primary cultures of rat striatal neurons. Brain Res. Mol. Brain Res. 86, 125-137 (2001).
- Oorschot, D. E. Effect of fluorodeoxyuridine on neurons and non-neuronal cells in cerebral explants. Exp. Brain Res. 78, 132-138 (1989).
- Price, P. J., Brewer, G. J., Federoff, S., Richardson, A. Serum -free media for neural cell cultures. Protocols for Neural Cell Culture. , (2001).
- Shen, J., Watanabe, S., Kaneko, A. Cell dissociation with papain reduces the density of cGMP-activated channels of the retinal rod. Jpn. J. Physiol. 45, 151-164 (1995).
- Stratmann, G., Sall, J. W., May, L. D., Loepke, A. W., Lee, M. T. Beyond anesthetic properties: The effects of isoflurane on brain cell death, neurogenesis and long-term neurocognitive function. Anesthesia and Analgesia. 110, 431-437 (2009).
- Wallace, T. L., Johnson, E. M. Cytosine arabinoside kills postmitotic neurons: evidence that deoxycytidine may have a role in neuronal survival that is independent of DNA synthesis. J. Neurosci. 9, 115-124 (1989).
