Identifisering av Protein Samspill Partners Bruke Tandem Affinity Rensing

Summary

Tandem affinitet rensing er en robust metode for identifisering av protein bindende partnere. Som bevis på konseptet, ble denne metoden brukt på godt karakterisert oversettelse initiering faktor eIF4E til co-fremskynde vertscellen faktorer involvert i oversettelse innvielse. Denne metoden er lett tilpasses enhver cellulær eller viral protein.

Abstract

En kritisk og ofte begrense skritt i å forstå funksjonen av host og virale proteiner er identifisering av å samhandle mobilnettet eller viral protein partnere. Det er mange tilnærminger som gjør identifiseringen av samvirkende partnere, inkludert gjær to hybrid system, samt trekke ned analyser ved hjelp av rekombinante proteiner og immunoprecipitation av endogene proteiner etterfulgt av massespektrometri identifikasjon ^1. Nyere studier har fremhevet nytten av dobbelt-affinitet tag mediert rensing, kombinert med to konkrete eluering trinn i identifiseringen av samvirkende proteiner. Denne tilnærmingen, kalt Tandem Affinity Renselse (TAP), ble opprinnelig brukt i gjær ^2,3 men mer nylig har blitt tilpasset til bruk i pattedyrceller ^4-8.

Som proof-of-concept har vi etablert en tandem affinitet renselse (TAP)-metoden bruker godt karakterisert eukaryote oversettelse initiering facTor eIF4E ^9,10. Den cellulære oversettelse faktoren eIF4E er en kritisk komponent i den cellulære eIF4F komplekset involvert i Cap-avhengige oversettelse initiering ^10. TAP tag brukt i denne studien består av to Protein G enheter og en streptavidin bindende peptid atskilt med en Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sekvens. TAP tag brukt i denne studien består av to Protein G enheter og en streptavidin bindende peptid atskilt med en Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sekvens ^åtte. For å gi avkall på behovet for generering av klonal cellelinjer, utviklet vi en rask system som bygger på den uttrykk for TAP-merkede agn protein fra en episomally opprettholdes plasmid basert på pMEP4 (Invitrogen). Uttrykk av merket murine eIF4E fra denne plasmid ble kontrollert ved hjelp av kadmium klorid induserbar metallothionein promoter.

Lyse av de uttrykker cellene og påfølgende affinitet rensing via binding til rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding til streptavidin knyttet agarose og påfølgende biotin eluering identifisert en rekke proteiner tilsynelatende spesifikke for eIF4E trekke ned (i forhold til styre cellelinjer som uttrykker TAP tag alene). Identiteten til de proteinene ble innhentet ved eksisjon av bandene fra 1D SDS-PAGE og påfølgende tandem massespektrometri. De identifiserte komponentene som følger de kjente eIF4E proteiner eIF4G og 4EBP-1. I tillegg andre deler av eIF4F komplekset, hvorav eIF4E er en komponent ble identifisert, nemlig eIF4A og Poly-A bindende protein. Evnen til å identifisere ikke bare kjent direkte bindende partnere samt sekundære samvirkende proteiner, fremhever videre nytten av denne tilnærmingen i karakterisering av proteiner med ukjent funksjon.

Protocol

1. Generering av cellelinjer: pMEP4 transfeksjon / uttrykket Transfektere celler med pMEP4 uttrykk vektor og velg med 100 mikrogram hygromycin B / ml (Roche) til alle mock transfekterte cellene har blitt drept av. Den pMEP4 plasmidet opprettholdes episomally så det er ikke nødvendig å isolere spesifikke kloner. Celler som inneholder pMEP4 vektoren kan settes i gang ved behandling med 10 mm CdCl 2 i 16 timer. Uttrykk og inducibility bør bekreftes på en liten skala før forsterkning av cellelinjer. TAP-tagget protein kan lett oppdages som protein G domener bindes til antistoffene fra nesten alle arter. For storskala renselser vanligvis 10 konfluent 175 cm 2 flasker av celler kreves. Dette tilsvarer ca 2 X10 8 uttrykke celler. 2. Cell lysate forberedelse Skrap celler inn i PBS og sammen til ett 50 ml tube. Spinn 1200X gfeller 5 minutter (dette skal resultere i 2-3 ml av pakkede celler til å begynne med, noe som reduserer til ca 1,5 ml etter vask). Vask cellene tre ganger i iskaldt PBS (50 MLS hver gang). Lyse cellene i 5 ml lysis buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 125 mm NaCl, 5% Glyserol, 0,2% NP-40, 1,5 mM MgCl 2, 25 mm NaF, 1 mM Na 3 VO 4 og protease inhibitor ). Merk: NaF, 3 Na VO 4 og proteasehemmere bør legges frisk. Pipettering opp og ned 10 ganger før avreise til 5 minutter på isen. Sprøyte opp og ned 5-10 ganger med en stump nål før du forlater igjen på is i 5 minutter på isen. Gjenta syringing og la stå i ytterligere 5 minutter på isen. Fryse-tine den lysate to ganger (flytende N 2 / eller tørris og etanol). Ikke la utvalget til å nå større enn 4 ° C. Merk: Du kan lagre denne prøven ved -80 ° C til du har tid til å behandle. Delmengde prøve til 1,5 ml rør og fjern lyserte celler og debris ved sentrifugering (10 minutter ved 4 ° C, 16 000 X g). Recover supernatant, kombinere i en 15 ml falk rør og (valgfritt) passerer gjennom en 0,45 mikrometer filter før du tar en 20 mL prøve for protein yield kvantifisering. Fjerne en ytterligere 50 mL delmengde for påfølgende analyse (Prøve 1). 3. Binding til Rabbit IgG-agarose (Merk: Alle spins bør utføres ved 1200X g i en nedkjølt sentrifuger ved 4 ° C i 1 minutt, hvis ikke annet er oppgitt) Forsiktig resuspender kanin IgG-agarose løsning (Sigma-Aldrich) ved å svinge flaske. Ta 380 mL av IgG agarose (ved hjelp av et kutt 1ml pipettespissen) og fjerne shipping / konserveringsmiddel løsning ved sentrifugering i 1 minutt. Vask agarose tre ganger i kjølt lysis buffer (4 ° C) ved hjelp av sentrifugering å avklare. Den endelige avkastningen av agarose bør være ca 250 mL av pakket perler. Tilsett ryddet cellen lysate fra 2,6 (i en 15 ml falk badekare) til den vasket kanin-IgG agarose og inkuber 3 timer (eller over natten) ved 4 ° C ved hjelp av en roterende blandebatteri. Spinn ned agarose perler i 5 minutter ved 4 ° C og fjern supernatanten for påfølgende analyse (Eksempel 2). Merk: TAP tagget protein skal nå være assosiert med perler. 4. TEV protease cleavage (Merk: Alle spins bør utføres ved 1200X g i en nedkjølt sentrifuger ved 4oC i 1 minutt, hvis ikke annet er oppgitt) Vask kanin IgG agarose perler tre ganger i kjølt lysis buffer (4 ° C) ved hjelp av sentrifugering for å avklare (merk: det lysis buffer bør ikke inneholde proteasehemmere). Forsiktighet bør utvises for ikke å fjerne eller miste noen perler i løpet av de vaske trappen. Vask perlene ytterligere to ganger med TEV-protease cleavage buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mm NaCl, og 0,2% NP-40) med sentrifugering å avklare. Etter siste vask forsiktig fjerne all liQuid fra perlene. Forbered en TEV protease cleavage mix, for hver prøve inkluderer 467,5 mL H 2 O, 25 mL 20x TEV Buffer (Invitrogen), 5 mL 0.1m DTT og 2,5 mL (25 U) TEV Protease (Invitrogen). Legg til 500 mL av denne TEV cleavage blandingen til hver prøve fullstappede perler og overføre hele blandingen til en 1,7 ml ferdigfylt smurt tube (CoStar). Før inkubasjon fjerne en 30 mL delmengde for påfølgende analyse (Prøve 3). Inkuber TEV protease reaksjon over natten ved 4 ° C ved hjelp av en roterende blandebatteri. Vær oppmerksom på at kortere Inkuberinger tider kan brukes avhengig av hva slags agn protein og tilgjengeligheten av TEV protease kuttesete men minimal inkubasjonstiden bør empirisk bestemt. 5. Binding til Ultralink immobilisert streptavidin Plus perler (Merk: Alle spins bør utføres ved 1200X g i en nedkjølt sentrifuger ved 4 ° C i 1 minutt, hvis ikke annet er oppgitt) </p> Sentrifuger TEV cleavage reaksjonen inneholder kanin IgG agarose perler i 5 minutter ved 1200X g (4 ° C). Ta en 20 mL delmengde av avklart supernatanten for analyse (Prøve 4) Overfør gjenværende supernatanten (ca 480 mL) til en frisk 1,5 ml ferdigfylt smurt tube (CoStar) og la dette på is. Ikke kast dette supernatanten – denne inneholder din TEV kløyvde agn protein og eventuelle tilknyttede bindende proteiner. Legg til 500 mL av kjølt lysis buffer (punkt 2.3) til de resterende kanin IgG agarose perler og Resuspender. Sentrifuger denne blandingen å avklare perlene før du fjerner supernatanten og kombinere det med det fra trinn 5,2. La dette røret på is (det skal nå inneholde ~ 980 mL av prøven). Beholde kanin IgG agarose perler for senere analyse (prøve 5). Merk: Hvis du kjører denne prøven på en SDS-PAGE gel (eller western blot) vil det gi mye av bakgrunnen på grunn av tilstedeværelsen av IgG tung og lettkjeder. Imens forsiktig resuspender den Ultralink immobiliserte streptavidin Plus agarose perler (Pierce) ved å svinge flasken. Ved hjelp av en 200 mL pipette med slutten cut, alikvoter 70 mL av streptavidin perler per prøven i pre-smurt 1,5 ml rør og fjern shipping / konserveringsmiddel løsning ved sentrifugering. Merk: Disse perlene er veldig små og så "duck-billed" eller flat / smal-ended tips kan brukes til å minimere perle tap under vask. Vask streptavidin perler tre ganger i kjølt lysis buffer (4 ° C) ved hjelp av sentrifugering å avklare. Dette bør la det være cirka 45-50 mL av pakket perler per tube. Overfør TEV-protease cleavage supernatanten (dvs. 980 mL av prøven fra trinn 5,3) til røret som inneholder vasket streptavidin perler og Inkuber i 3 timer (eller over natten) ved 4 ° C ved hjelp av en roterende blandebatteri. Spinn ned streptavidin perlene i 5 minutter ved 4 ° C og fjern supernatanten for påfølgende analyse (SamPLE 6). Vask streptavidin perler tre ganger i kjølt lysis buffer (4 ° C) ved hjelp av sentrifugering å avklare. Etter den siste vask, forsiktig fjerne all gjenværende vaskebuffer. 6. Biotin eluering av streptavidin bindende peptid og agn protein (Merk: Alle spins bør utføres ved 1200X g i en nedkjølt sentrifuger ved 4 ° C i 1 minutt, hvis ikke annet er oppgitt) Eluer tagget proteiner fra streptavidin perlene ved å legge 500 mL PBS: Biotin (1 mm D-biotin) og ruger ved 4 ° C i 3 timer (eller over natten) ved hjelp av en roterende blandebatteri. Spinn ned streptavidin perlene i 5 minutter ved 4 ° C og fjern supernatanten til et 1,5 ml ferdigfylt smurt tube (Merk: dette er den endelige prøven / eluering (Sample 7). Legg til en annen 500 mL Biotin: PBS til de gjenværende streptavidin perler og inkuber ved 4 ° C i 2-3 timer (eller over natten) ved hjelp av en roterende blandebatteri. Retorv trinn 6,2 og kombinere de to elutions (prøve 7). Denne endelige eluering kan oppbevares ved -80 ° C. For å vurdere effektiviteten av biotin eluering, fryse de resterende streptavidin perler og koke senere i SDS prøve buffer (Sample 8) (anbefalinger: LaneMarker 5x redusere prøve buffer fra Fisher). 7. Protein konsentrasjon Den endelige eluatet (Sample 7) må være konsentrert før analyse på grunn av lav protein konsentrasjon og relativt høyt volum. Dette kan oppnås ved hjelp av lav molekylvekt (<5 kda) vivaspin spin kolonner (vivascience). tar sikte på å konsentrere volumet ned til mindre enn 100 ml. denne endelige prøven kan kokes og oppbevares i protein prøve buffer (anbefalinger: lanemarker 5x redusere fra fisher). 8. analyse prøver 1-8 analyseres ved western blot for fastslå effektiviteten av trekke ned. merk: de fleste sekundære antistoffer vilkryssreagerer med g domener fusion protein, men dette er fjernet etter tev protease cleavage. eksempel 7 1d eller 2d sds-page. farging utføres hjelp sølv coomassie silverquest flekker kolloidale blue kits invitrogen). identifikasjon massespektrometri. 9. representative resultater et sds-page den eluering (sample 7) protokollen identifisere bindende partnere tap tagget eif4e gitt figur 2. representanten gel gjenspeiler komplekse rikelig natur interaksjoner andre proteiner cellen. sammenligning negative kontrollen også vist 2, generert en cellelinje som uttrykker bare tag, illustrerer det spesielle agnet rullegardinmenyen. tilfellet 15% konsentrert (sample7) ble analysert bruke kommersielt tilgjengelige pre-cast gradient før blir farget kit invitrogen. typisk 50-85% resterende kolloidalt flekk (invitrogen). (gel skiver >

Discussion

TAP tagging teknikken illustrert her demonstrerer en svært bestemt og streng metode for å isolere bindende partnere av agn proteiner i eukaryote celler. Denne tilnærmingen kan brukes til både cellulære og viral proteiner. Så vidt vi vet er dette første gang en slik teknikk har blitt brukt på oversettelsen innvielse faktor eIF4E. Identifikasjon av den kjente eIF4E bindende proteiner eIF4G og 4EBPs bruke denne teknikken bekrefter gyldigheten av en slik tilnærming. I tillegg har identifisering av den gjenværende delen av eIF4F komplekse, bekrefter nemlig eIF4A, og PABP som indirekte samhandling og tertiære komplekser forbli intakt under renseprosessen. Identifiseringen av flere isoformer av de kanoniske eIF4e proteiner var også tydelig. Disse er beskrevet nærmere i figur 2.

Med hensyn til begrensningene i tilnærmingen, bør visse forsiktighet tas med hensyn til valgav agn protein og om ikke å plassere TAG-koden på N-eller C-terminus. Det kan være lurt å foreta en funksjonell analysen eller undersøke lokalisering av fusion protein ved mikroskopi før full skala rensing for å sikre at tagget deriverte er funksjonell. Integral membran eller kjernefysiske proteiner kan ikke nødvendigvis bli utgitt av de relativt mildt vaskemiddel forhold som beskrives i lysis trinn. Som med alle immunoprecipitations og lignende pull-down analyser, kan endringer gjøres til natur og konsentrasjoner av vaskemiddel i lysis buffer for å øke effektiviteten i lysis. Den ioniske konsentrasjonen av lysis og vask buffere kan også bli modifisert for å øke eller redusere stringens av renselse. Det er også mulig å utføre innledende rensing under standard milde betingelser (beskrevet ovenfor), men senere dele streptavidin perlene (pkt. 5.8) inn 4-5 alikvoter, som senere kan vaskes under økende ionisk condene. Dette kan gjøre det mulig for brukeren å identifisere de optimale forholdene som fjerner ikke-spesifikke samspill proteiner. Hele prosessen kan også utføres ved hjelp forbigående transfeksjon hvor samvirkende partnere er kjent og deres tilstedeværelse eller fravær fastsatt av påfølgende Western blot bare. I dette tilfellet vil vi foreslå to 100cm ² retter av celler hver transfekterte med 8 mikrogram uttrykk plasmid. Denne modifiserte prosedyren er særlig nyttig når undersøke muligheten av muterte derivater av TAP-fusion protein for å samhandle med kjente bindende partnere.

Analysere prøver 1 til 8 på sølv farget SDS-PAGE gel (eller Western blot hvis et antistoff er tilgjengelig) er en utmerket måte å feilsøking, bør teknikken klarer å generere akseptable resultater. Effektiviteten av hver affinitet baserte nedbør og spesifikk eluering kan analyseres ved hjelp av denne systematiske prøvetaking tilnærmingen. Prøver ett til åtte må tas i løpet av optimvisualisering av protokollen for hver nye agn.

TAP tagging teknikk gir en kraftig og robust alternativ til andre tilnærminger som GST rullegardinlistene, gjær to hybrid-analyser etc. dobbel tilhørighet rensing og konkrete eluering trinn (TEV cleavage og biotin eluering) gi spesifisitet og stringens som skal opprettholdes på en høyt nivå gjennom hele rensing prosedyren. Kritisk denne teknikken kan brukes på alle protein og representerer derfor en utmerket metode for å identifisere bindende partnere for et protein mål av interesse.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Hygromycin B	Roche	10843555001
Rabbit IgG Agarose	Sigma	A2909
AC-TEV Protease	Invitrogen	12575-015
Protease inhibitor cocktail	Calbiochem	539134
Ultralink Immobilized Streptavidin Plus beads	Pierce	53116
Vivaspin 500 centrifugal concentrator (5KDa)	Vivaspin	V50112
SilverQuest silver staining kit	Invitrogen	LC6070
Novex Colloidal Blue Coomassie staining kit	Invitrogen	LC6025
1.7ml prelubricated tubes	Costar	3207
Microcapillary pipette tips	VWR	37001-150
NuPage 4-12% Bis-Tris gradient gels	Invitrogen	NP0322BOX
CdCl2	Sigma	202908
5x SDS Sample Buffer	Fisher	PN39000