Tandem affinitetsrening är en robust metod för identifiering av proteinbindning partners. Som bevis på konceptet, var denna metod tillämpas på väl karakteriserade translationsinitiering faktor eIF4E till samarbete fälla ut värdcellens faktorer inblandade i translationsinitiering. Denna metod kan lätt anpassas till någon cellulärt eller viralt protein.
En kritisk och ofta steget för att förstå funktionen av värd och virala proteiner är identifieringen av interagerande cellulära eller virala proteinpartner. Det finns många metoder som gör det möjligt att identifiera interagerande partner, inklusive jästen två hybridsystemet samt dra ner analyser med hjälp av rekombinanta proteiner och immunoprecipitation av endogena proteiner följt av masspektrometri identifiering 1. Nyligen genomförda studier har visat nyttan av dubbel-affinitetsmarkör medierad rening, tillsammans med två specifika eluerings steg i identifieringen av interagerande proteiner. Detta tillvägagångssätt, som kallas Tandem Affinity Purification (TAP), användes ursprungligen i jäst 2,3 men på senare tid har anpassats för användning i däggdjursceller 4-8.
Som proof-of-concept har vi etablerat en tandem affinitetsrening (TAP)-metoden med hjälp av väl karakteriserade eukaryota translationsinitiering FACTor eIF4E 9,10. Den cellulära översättningen faktorn eIF4E är en kritisk komponent i cellulära eIF4F komplexet involverade i Cap-beroende translationsinitiering 10. TAP taggen används i den aktuella studien är sammansatt av två enheter protein G och ett streptavidin-bindande peptid separeras genom en tobacco etch virus (TEV) proteas-klyvningssekvensen. TAP taggen används i den aktuella studien är sammansatt av två enheter protein G och ett streptavidin-bindande peptid separeras genom en tobacco etch virus (TEV-proteas) klyvningssekvens 8. Att avstå från behovet av generering av klonala cellinjer, har vi utvecklat ett system för snabbt som bygger på uttrycket av TAP-märkta bete protein från en episomalt upprätthålls plasmid baserad på pMEP4 (Invitrogen). Uttryck av taggade mus eIF4E från denna plasmid kontrollerades med hjälp av kadmiumklorid promotorn inducerbar metallotionein.
Lys av celler som uttrycker och efterföljande affinitetsrening via bindning till rabbit IgG agaros, TEV-proteas klyvning, bindning till streptavidin kopplat agaros och efterföljande eluering biotin funnit många proteiner uppenbarligen är specifika för eIF4E nedkretsen (jämfört med kontroll-cellinjer som uttrycker den TAP-taggen enbart). Identiteterna för de proteiner som erhålls genom utskärning av banden från 1D SDS-PAGE och efterföljande tandemmasspektrometri. De identifierade komponenter som ingår kända eIF4E bindande proteiner eIF4G och 4EBP-1. Dessutom kan andra komponenter i eIF4F komplex, av vilka eIF4E är en komponent identifierades, nämligen eIF4A och poly-A-bindande protein. Förmågan att identifiera inte bara kända direkta bindande partners samt sekundära samverkande proteiner, understryker ytterligare nyttan av detta synsätt i karakterisering av proteiner av okänd funktion.
TAP märkning som illustreras här visar en hög specificitet och stringenta förfarande för isolering av de bindande partnerna av bete proteiner i eukaryota celler. Detta tillvägagångssätt kan tillämpas på både cellulära och virala proteiner. Såvitt vi vet är detta första gången en sådan teknik har använts på translationsinitiering faktorn eIF4E. Identifiering av kända eIF4E bindande proteiner eIF4G och 4EBPs med denna teknik bekräftar giltigheten av ett sådant tillvägagångssätt. Dessutom, identifiering av den återstående delen av eIF4F komplex bekräftas nämligen eIF4A och PABP att indirekt interaktion och tertiära komplex förblir intakt under reningsprocessen. Identifieringen av multipla isoformer av de kanoniska eIF4e bindande proteiner var också tydlig. Dessa beskrivs mer i detalj i figur 2.
När det gäller begränsningarna i metoden bör vissa försiktighet iakttas när det gäller valetav betesprotein och huruvida eller inte för att placera taggen TAG vid N-eller C-terminalen. Det kan vara tillrådligt att utföra en funktionell analys eller undersöka den lokalisering av fusionsproteinet med hjälp av mikroskopi före full skala rening för att säkerställa den märkta derivatet är funktionell. Integralt membranprotein eller nukleära proteiner behöver inte nödvändigtvis att frigöras från de relativt milda rengöringsmedel förhållanden som beskrivs i lyssteget. Som med alla immunoutfällningar och liknande pull-down-analyser, kan modifieringar göras av arten och koncentrationen av detergenten i lysbuffert för att öka effektiviteten av lys. Jonkoncentrationen av lys och tvätt buffertar kan också modifieras för att öka eller minska stringens för rening. Det är också möjligt att utföra den inledande reningen under normala milda förhållanden (beskrivet ovan), men därefter dela streptavidinpärloma (avsnitt 5,8) i 4-5 portioner, som därefter kan tvättas under allt joniska konförutsättningar. Detta kan göra det möjligt för användaren att identifiera de optimala betingelser som avlägsnar icke-specifika interagerande proteiner. Hela processen kan också genomföras med användning av transient transfektion där de samverkande partner är kända och deras närvaro eller frånvaro bestämdes genom efterföljande Western blöt endast. I det här fallet skulle vi föreslå två 100cm 2 skålar av celler varje transfekterad med 8 pg av expressionsplasmiden. Denna modifierade procedur är särskilt användbar vid undersökning av förmågan hos muterade derivat av den TAP-fusionsproteinet för att samverka med kända bindningspartners.
Analys av prover 1 till 8 på silverfärgade SDS-PAGE-geler (eller genom western blöt om en antikropp är tillgänglig) är ett utmärkt sätt felsökning, bör den teknik misslyckas med att generera ett acceptabelt resultat. Effektiviteten av varje affinitet baserade nederbörd och specifika eluering kan analyseras med denna systematiska urvalsmetod. Prover en till åtta bör vidtas under Optimnisation av protokollet för varje ny bete.
TAP märkning Tekniken ger ett kraftfullt och robust alternativ till andra metoder såsom GST nedkretsarna, jäst två hybrid analyser etc. Den dubbla affinitetsrening och särskilda åtgärder elueringsbetingelser (TEV klyvning och biotin eluering) ger specificitet och stringens hållas vid en hög nivå under hela reningsförfarandet. Kritiskt denna teknik kan tillämpas på vilket protein som helst och därför representerar en utmärkt metod för att identifiera bindande partners för ett protein målet av intresse.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning har finansierats av ett Wellcome Trust Senior Fellowship ut till Dr Ian Goodfellow.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Hygromycin B | Roche | 10843555001 |
Rabbit IgG Agarose | Sigma | A2909 |
AC-TEV Protease | Invitrogen | 12575-015 |
Protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539134 |
Ultralink Immobilized Streptavidin Plus beads | Pierce | 53116 |
Vivaspin 500 centrifugal concentrator (5KDa) | Vivaspin | V50112 |
SilverQuest silver staining kit | Invitrogen | LC6070 |
Novex Colloidal Blue Coomassie staining kit | Invitrogen | LC6025 |
1.7ml prelubricated tubes | Costar | 3207 |
Microcapillary pipette tips | VWR | 37001-150 |
NuPage 4-12% Bis-Tris gradient gels | Invitrogen | NP0322BOX |
CdCl2 | Sigma | 202908 |
5x SDS Sample Buffer | Fisher | PN39000 |