Infeksjon av mus med en Adenovirus uttrykker humane autoantigen cytokrom P450 2D6 (hCYP2D6) anerkjent av sera av pasienter som lider av type 2 autoimmun hepatitt resultater i en vedvarende form for autoimmun-mediert leversykdom preget av omfattende hepatitt, fibrose og generering av en CYP2D6 -spesifikk immunrespons.
Autoimmun hepatitt er en sjelden, men livstruende autoimmun sykdom i leveren av ukjent etiologi 1,2. I de siste mange forsøk har blitt gjort for å generere en dyremodell som reflekterer egenskapene til menneskelig sykdom 3-5. Men i ulike modeller induksjon av sykdommen var ganske komplisert og ofte hepatitt var bare forbigående 3-5. Derfor har vi utviklet en grei mus modell som bruker de store menneskelige autoantigen i type 2 autoimmun hepatitt (AIH-2), nemlig hCYP2D6, som en utløser seks. Type 1 lever-nyre mikrosomale antistoffer (lkm-1) antistoffer som anerkjenner hCYP2D6 er kjennemerket for AIH-2 7,8. Levering av hCYP2D6 inn hvete FVB eller C57BL / 6 mus var av en Adenovirus konstruksjon (Ad-2D6) som sikrer en direkte levering av den utløsende antigen til leveren. Dermed genererer den påfølgende lokal betennelse en fruktbar felt 9 for den videre utviklingen av autoimmunitet. A combination av intravenøs og intraperitoneal injeksjon av Ad-2D6 er den mest effektive veien til indusere en langvarig autoimmun skade på leveren (§ 1). Her gir vi en detaljert protokoll om hvordan autoimmun leversykdom er indusert i CYP2D6-modellen og hvordan de ulike aspekter av leverskader kan vurderes. Først er serumnivået av markører som indikerer hepatocytter ødeleggelse, slik som leveraminotransferaser, samt titer av hCYP2D6 antistoffer bestemmes ved prøvetaking blod retroorbitaly (§ 2). Deretter får hCYP2D6-spesifikke T-celle respons karakterisert ved å samle lymfocytter fra milten og leveren. For å få rene lever lymfocytter, er leveren perfused av PBS via portvenen (§ 3), fordøyd i kollagen og renset over en Percoll gradient (§ 4). Hyppigheten av hCYP2D6-spesifikke T celler blir analysert ved stimulering med hCYP2D6 peptider og identifisering av IFNγ-produserende celler med flowcytometri (§ 5). Tredje,cellulær infiltrasjon og fibrose bestemmes ved immunhistokjemi av lever seksjoner (§ 6). En slik analyse diett må være gjennomført på flere ganger etter oppstart av sykdommen for å bevise at kronisk art av modellen. Størrelsen på immunresponsen preget av hyppigheten og aktiviteten hCYP2D6-spesifikke T og / eller B celler og graden av leverskade og fibrose må vurderes for en senere evaluering av mulige behandlinger for å forebygge, forsinke eller oppheve den autodestructive Prosessen i leveren.
I tidligere studier, ble eksperimentelt hepatitt ofte rapportert å være bare forbigående og mange aktuelle modeller for autoimmun leversykdom bero på en ganske kompleks sykdom induksjon protokoller (for vurderinger se 3,5). For eksempel flere modeller bruker transgene mus som uttrykker bestemte geografiske antigener og adoptively overført mål antigen-spesifikke, for det meste TCR-transgene, T celler 14,15. Ofte en ekstra infeksjon med livertropic virus, bakterier eller parasitter er nødvendig for å indusere sykdom 16-18. Alternativt er DNA-vaksinering med plasmider som koder for målet antigener, herunder CYP2D6 19, brukes til å indusere hepatitt. Men en ekstra vaksinering med plasmider som koder for pro-inflammatoriske cytokiner, som IL-12, kreves 20. Dessverre, med noen få unntak 15,20 hepatitt er bare forbigående.
CYP2D6-modellen 6,21 bruker en grei metode to indusere autoimmun hepatitt ved å infisere mus med en Adenovirus uttrykker hCYP2D6, den store autoantigen i AIH-2 7,8. Levering av CYP2D6 ved en adenovirus konstruksjon garanterer både en direkte målretting av leveren samt en lokal betennelse som fremmer nedbrytningen av toleranse. Det er viktig å merke seg at både virus titer samt tilførselsvei er avgjørende for denne modellen. På den ene siden, er Ad-2D6 en replikering mangelfull virus, og dermed en tilstrekkelig høy titer av virus er nødvendig for å generere en kritisk mengde antigen i leveren. På den annen side kan en for høy titer resultere i en fatal akutt leversvikt. I tillegg har det blitt vist tidligere at smitte av mus med høye titer av adenovirus fører til en funksjonell utmattelse av immunrespons 22. I vår modell har vi brukt en kombinasjon av intravenøs og intraperitoneal smitte for å oppnå både kroniske cellulær infiltrasjon, samt utvensive fibrose. Vi har observert at intravenøs infeksjon alene fortsatt forårsaker massive mobilnettet infiltrasjon, men ingen fibrose av subkapsulær regionen, noe som indikerer at peritoneal betennelse på grunn av intraperitoneal injeksjon kan være involvert i den kontinuerlige subkapsulær akkumulering av kollagen (Hintermann & Christen, manuskript under utarbeidelse). Det er imidlertid viktig å merke seg at den observerte leverfibrose er antigen-spesifikk, siden vi ikke påvise aktivering av hepatiske stellate celler og kollagen deponering etter smitte med like virus-titer av Ad-GFP eller Ad-Control 23.
CYP2D6-modellen gjenspeiler mange aspekter ved menneskelig AIH 1,2, som kronisk hepatitt karakteriseres av vedvarende cellulære infiltrasjon og leverfibrose 6. I tillegg indikerer tilstedeværelse av høy-titer anti-CYP2D6 antistoffer med lignende epitop spesifisitet og spredning 13 til lkm-1 antistoffer funnet i AIH-2 pasienter presans for en felles kronisk autoimmun reaktivitet. CYP2D6 er den viktigste antigenet i AIH-2, men det blir ikke gjenkjent av pasienter diagnostisert med hyppigere type 1 AIH. I tillegg har pasienter som lider av andre leversykdommer med autoimmun etiologi, slik som primær biliær cirrhose (PBC) eller primær skleroserende kolangitt (PSC), genererer typiske autoantistoffer med spesifisitet til distinkte lever autoantigens og deres lever viser ulike patologiske funksjoner sentreringskontrollene på små (PBC ) eller store (PSC) gallegangene. Likevel tilbyr CYP2D6 modellene muligheten til å analysere immunopathogenic mekanismene som er involvert i kronisk nedsatt inflammatoriske prosesser som oppstår i løpet av autoimmune leversykdommer, for å identifisere viktige aktører som driver autoimmun ødeleggelse av hepatocytter og å vurdere mulige terapeutiske intervensjoner for å kurere sykdommen.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet er støttet av Goethe Universitetssykehuset Frankfurt og et tilskudd på den tyske Research Foundation til UC
Name of the equipment | Company | Catalogue number | Comments |
23G needle | BD Biosciences | 300800 | |
27½G needle | VWR | 612-0151 | |
30½ G needle | BD Biosciences | 304000 | |
Alanine aminotransferase test strips (GPT/ALT) | Roche Diagnostics | 10 745 138 202 | |
Aspartate aminotransferase test strips (GOT/AST) | Roche Diagnostics | 10 745 120 202 | |
Anaesthesia Unit Univentor 400 | AgnTho’s | ||
Base molds, disposable 37x24x10 mm | VWR | 720-0208 | |
Cell strainer 70mm | VWR | 734-0003 | |
Cryostat | Leica | CM1850 UV | |
Heparinized capillary tubes | Fisher | 3123987 | |
Microscope slides Superfrost Plus | Menzel Gläser | J1800AMNZ | |
Microtainer SST tubes | BD Biosciences | 365951 | |
Microtiter plates, V-bottom | VWR | 391-1924 | |
Reflotron Plus | Roche Diagnostics | Determiniation of serum AST / ALT | |
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Rabbit anti-mouse anti-Collagen type I IgG, | Chemicon | AB765P | |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector (AXXORA) | VC-BA-1000-MC15 | |
FITC-conjugated anti mouse CD8a antibody | Southern Biotech | 1550-02 | |
PE-conjugated anti mouse IFNγ antibody | BD Biosciences | 554412 | |
PE-conjugated anti-mouse CD16/CD32 antibody (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | |
Aquatex | VWR | 1.08562.0050 | |
Avidin/Biotin Blocking kit | Vector (AXXORA) | VC-SP-2001-KI01 | |
Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
Collagenase IV | Sigma | C5138-100MG | |
DAB substrate kit 3’3’diaminobenzidine | Vector (AXXORA) | VC-SK-4100-KI01 | |
DNase | Sigma | DN-25 | |
Elite ABC Reagent | Vector (AXXORA) | VC-PK-7100-L050 | |
Eosin G/Y solution | Roth | X883.1 | |
Fetal calf serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | |
Isofluran | Forene | B506 | |
Meyer’s Hematoxylin solution | AppliChem | A4840,1000 | |
OCT Compound | Sakura Finetek Europe | 4583 | |
PBS-buffered formaldehyde 10% | Roth | A146.3 | |
Percoll | Amersham | 17-0891-01 | |
Roti-Histokit | Roth | 6638.1 | |
RPMI | Invitrogen | 61870 | |
Saponin from quillaja bark | Sigma | S7900 |