Infektion af mus med en Adenovirus udtrykker den vigtigste humane autoantigenet cytochrom P450 2D6 (hCYP2D6) anerkendt af sera af patienter, der lider type 2 autoimmun hepatitis resultater i en vedvarende form af autoimmun-medieret leversygdom kendetegnet af omfattende hepatitis, fibrose og generering af en CYP2D6 -specifikt immunrespons.
Autoimmun hepatitis er en sjælden, men livstruende autoimmun sygdom i leveren af ukendt ætiologi 1,2. I de sidste mange forsøg er blevet gjort til at generere en dyremodel der afspejler de særlige kendetegn ved den humane sygdom 3-5. Men i forskellige modeller induktion af sygdommen var temmelig kompleks og ofte hepatitis var kun forbigående 3-5. Derfor, har vi udviklet en ligetil musemodel der bruger de primære humane autoantigenet i type 2 autoimmun hepatitis (AIH-2), nemlig hCYP2D6, som en udløser 6. Type 1 lever-nyre mikrosomale antistoffer (LKM-1) antistoffer, som genkender hCYP2D6 er kendetegnende for AIH-2 7,8. Levering af hCYP2D6 ind vild-type FVB eller C57BL / 6 mus var ved en Adenovirus konstrukt (Ad-2D6), der sikrer en direkte levering af det udløsende antigenet til leveren. Således efterfølgende lokal inflammation genererer en frugtbar felt 9 for den efterfølgende udvikling af autoimmunitet. A combination af intravenøs og intraperitoneal injektion af Ad-2D6 er den mest effektive vej til at fremkalde en langvarig autoimmun skader på leveren (afsnit 1). Her giver vi en detaljeret protokol om, hvordan autoimmun leversygdom induceres i CYP2D6-modellen, og hvordan de forskellige aspekter af leverskader kan vurderes. Det første er de serumniveauerne af markører indikerer hepatocyttransplantation destruktion, såsom aminotransferaser, såvel som de titere af hCYP2D6 antistoffer bestemmes ved opsamling blod retroorbitaly (afsnit 2). Det andet, er den hCYP2D6-specifik T-celle respons karakteriseret ved opsamling lymfocytter fra milten og leveren. For at opnå rene lever lymfocytter, de lever perfuseres af PBS via portalen vene (afsnit 3), fordøjet i kollagen og renset over en Percoll gradient (afsnit 4). Hyppigheden af hCYP2D6-specifikke T-celler bliver analyseres ved stimulering med hCYP2D6 peptider og identifikation af IFNy-producerende celler ved flowcytometri (afsnit 5). Tredje,cellulær infiltration og fibrose bestemmes ved immunohistokemi af lever sektioner (afsnit 6). En sådan analyse regimen skal udføres på flere gange efter initiering af sygdommen med henblik på at bevise den kroniske karakter af modellen. Størrelsen af den immunrespons kendetegnet ved den hyppighed og aktiviteten af hCYP2D6-specifikke T og / eller B-celler og graden af leveren skaderne og fibrose er nødt til at skal vurderes for en efterfølgende evaluering af mulige behandlinger at forebygge, forsinke eller det ophæver autodestructive proces af leveren.
I tidligere studier blev eksperimentel hepatitis ofte rapporteret at være kun transiente og mange aktuelle modeller for autoimmun leversygdom afhænge en temmelig kompleks sygdom induktion protokoller (for bedømmelser se 3,5). For eksempel, bruge adskillige modeller transgene mus udtrykker specifikke målantigener og adoptivt overført target antigenspecifikke-specifikke, hovedsagelig TcR-transgene, T-celler 14,15. Ofte en yderligere infektion med livertropic vira, bakterier eller parasitter er noedvendigt at inducere sygdom 16-18. Alternativt, er DNA-vaccination med plasmider kodende for målantigenerne, herunder CYP2D6 19, anvendes til at fremkalde hepatitis. Imidlertid en yderligere vaccination med plasmider der koder for pro-inflammatoriske cytokiner, såsom IL-12, er forpligtet til 20. Desværre, med få undtagelser 15,20 hepatitis er kun forbigående.
Den CYP2D6 Modellen 6,21 benytter en meget ligefrem metode to inducere autoimmun hepatitis ved simpelthen inficere mus med en Adenovirus udtrykker hCYP2D6, den største autoantigenet i AIH-2 7,8. Levering af CYP2D6 ved at en adenovirus konstrukt garanterer både en direkte målretning af leveren såvel som en lokal inflammation der fremmer nedbrydningen af tolerance. Er det vigtigt at bemærke imidlertid at både virustiter såvel som indgivelsesvejen er afgørende for denne model. På den ene side, er Ad-2D6 en replikations deficient virus, dermed, en tilstrækkelig høj titer af virus er nødvendig for at generere en kritisk mængde af antigen inden for det leveren. På den anden side, måske for høj en titer resultere i en fatal akut leversvigt. Derudover, er det blevet demonstreret tidligere, at infektion af mus ved høje titere af adenovirus fører til en funktionel konsumption af den immunresponset 22. I vores model, brugte vi en kombination af intravenøs og intraperitoneal infektion for at opnå både kronisk cellulær infiltration såvel som extensive fibrose. Vi har observeret at intravenøs infektion alene stadig forårsager massiv cellulær infiltration, men ingen fibrose af den subkapsulær regionen, hvilket indikerer, at peritoneal inflammation på grund på den intraperitoneale injektion måtte være involveret i den kontinuerlige subkapsulær akkumulering af collagen (Hintermann & Christen, manuskript under udarbejdelse). Det er imidlertid vigtigt at bemærke, den observerede hepatisk fibrose er antigen-specifik, da vi ikke registrerer aktivering af hepatiske stjerneformige celler og collagen deposition efter infektion med lige virus-titere af Ad-GFP eller Ad-Control 23.
Den CYP2D6 model afspejler mange aspekter af menneskelig AIH 1,2, såsom kronisk hepatitis karakteriseret ved vedvarende cellulær infiltration og leveren fibrose 6. Derudover, indikerer tilstedeværelse af høj-titer anti-CYP2D6 antistoffer med lignende epitop specificitet og spredning 13 til LKM-1 antistoffer fundet i AIH-2 patienter præsnaevre betydning af en fælles kronisk autoimmun reaktivitet. CYP2D6 er den største antigen i AIH-2, men det er ikke anerkendt af patienter diagnosticeret med hyppigere type 1 AIH. Derudover,, patienter, der lider fra andre lever sygdomme med autoimmun ætiologi, såsom primær biliær cirrhose (PBC) eller primær skleroserende cholangitis (PSC) generere kendetegnende autoantistoffer med specificitet til distinkte lever autoantigener og påhængskøretøjer lever vise forskellige patologiske træk centrerende på lille (PBC ) eller store (PSC) galdegangene. Ikke desto mindre CYP2D6 modeller giver mulighed for at analysere immunopathogenic mekanismer, der er involveret i kroniske hepatiske inflammatoriske processer, som opstår under autoimmune leversygdomme, at identificere de vigtigste spillere, der driver autoimmun ødelæggelse af hepatocytter og for at evaluere mulige terapeutiske interventioner at helbrede sygdommen.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er støttet af Goethe-universitetet Hospital Frankfurt og et tilskud af den tyske Research Foundation til UC
Name of the equipment | Company | Catalogue number | Comments |
23G needle | BD Biosciences | 300800 | |
27½G needle | VWR | 612-0151 | |
30½ G needle | BD Biosciences | 304000 | |
Alanine aminotransferase test strips (GPT/ALT) | Roche Diagnostics | 10 745 138 202 | |
Aspartate aminotransferase test strips (GOT/AST) | Roche Diagnostics | 10 745 120 202 | |
Anaesthesia Unit Univentor 400 | AgnTho’s | ||
Base molds, disposable 37x24x10 mm | VWR | 720-0208 | |
Cell strainer 70mm | VWR | 734-0003 | |
Cryostat | Leica | CM1850 UV | |
Heparinized capillary tubes | Fisher | 3123987 | |
Microscope slides Superfrost Plus | Menzel Gläser | J1800AMNZ | |
Microtainer SST tubes | BD Biosciences | 365951 | |
Microtiter plates, V-bottom | VWR | 391-1924 | |
Reflotron Plus | Roche Diagnostics | Determiniation of serum AST / ALT | |
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Rabbit anti-mouse anti-Collagen type I IgG, | Chemicon | AB765P | |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector (AXXORA) | VC-BA-1000-MC15 | |
FITC-conjugated anti mouse CD8a antibody | Southern Biotech | 1550-02 | |
PE-conjugated anti mouse IFNγ antibody | BD Biosciences | 554412 | |
PE-conjugated anti-mouse CD16/CD32 antibody (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | |
Aquatex | VWR | 1.08562.0050 | |
Avidin/Biotin Blocking kit | Vector (AXXORA) | VC-SP-2001-KI01 | |
Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
Collagenase IV | Sigma | C5138-100MG | |
DAB substrate kit 3’3’diaminobenzidine | Vector (AXXORA) | VC-SK-4100-KI01 | |
DNase | Sigma | DN-25 | |
Elite ABC Reagent | Vector (AXXORA) | VC-PK-7100-L050 | |
Eosin G/Y solution | Roth | X883.1 | |
Fetal calf serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | |
Isofluran | Forene | B506 | |
Meyer’s Hematoxylin solution | AppliChem | A4840,1000 | |
OCT Compound | Sakura Finetek Europe | 4583 | |
PBS-buffered formaldehyde 10% | Roth | A146.3 | |
Percoll | Amersham | 17-0891-01 | |
Roti-Histokit | Roth | 6638.1 | |
RPMI | Invitrogen | 61870 | |
Saponin from quillaja bark | Sigma | S7900 |