Enkel og robust In vivo Og In vitro Approach for å studere Virus Assembly
Summary
En enkel, effektiv og robust måte å synkronisere levering av flere virale komponenter til planteceller via<em> Agrobacterium</em>-Mediert forbigående uttrykk er beskrevet. Denne tilnærmingen er mottagelig for å studere replikering, etterfulgt encapsidation av<em> In vitro</em> Remontering av ikke-virale komponenter i genomet utarmet optiske virale spøkelser egnet for biomedisinske applikasjoner.
Abstract
I virus med positiv-sense RNA genomet patogene for mennesker, dyr og planter, avkom encapsidation til modne og stabile virioner er en kardinal fase under etablering av infeksjon i en gitt host. Følgelig deciphers studie av encapsidation informasjon om know-how av mekanismen regulere viruset forsamlingen til å danne smittsomme virioner. Slik informasjon er viktig i utformingen av nye metoder for å dempe viruset spres og sykdomskontroll. Virus encapsidation kan studeres in vivo og in vitro. Genome encapsidation in vivo er en svært regulert selektiv prosess som involverer makromolekylær interaksjoner og subcellulære compartmentalization. Derfor studerer fører til dissekere hendelser som omfatter virus encapsidation in vivo ville gi grunnleggende kunnskap for å forstå hvordan virus sprer og montere. Nylig in vitro encapsidation har vært utnyttet til forskning på området i biomedisinsk imaGing og terapeutiske anvendelser. Ikke-kappekledde plante virus stå langt fremme i venture av in vitro encapsidation av negativt ladet utenlandsk materiale. Brome mosaic virus (BMV), en ikke-kappekledde multikomponente RNA virus patogene for planter, har vært brukt som en modell for å studere genomet emballasje in vivo og in vitro. For encapsidation analyser i Nicotiana benthamiana planter, Agrobacterium-mediert forbigående uttrykk, kaller agroinfiltration, er en effektiv og robust teknikk for den synkroniserte levering og uttrykk av flere komponenter til samme celle. I denne tilnærmingen, er en suspensjon av Agrobacterium tumefaciens celler som frakter binære Plasmid vektorer bærer cDNAs av desiredviral mRNAs infiltrerte intercellular verdensrommet withina blad med noe mer sofistikert enn en 1 ml engangssprøyte (uten nål). Denne prosessen resulterer i overføring av DNA setter inn planteceller, T-DNASett forblir midlertidig i kjernen og blir deretter transkribert av verten polymerase II, som fører til forbigående uttrykk. Den resulterende mRNA transkripsjon (avkortet og polyadenylated) blir deretter eksportert til cytoplasma for oversettelse. Etter ca 24 til 48 timer inkubasjon, kan deler av infiltrert blader tas prøver for microscopyor biokjemiske analyser. Agroinfiltration tillater store tall (hundrevis til tusenvis) av celler som skal transfekterte samtidig. For in vitro encapsidation, rensede virioner av BMV er dissosiert til kapsid protein ved dialyzing mot dissosiasjon buffer som inneholder kalsiumklorid etterfulgt av fjerning av RNA og un-dissosiert virioner ved sentrifugering. Genomet utarmet kapsid protein subenheter er montert igjen med ønskede virusgenomet komponenter eller ikke-virale komponenter som indocyanine fargestoff.
Protocol
Discussion
Agroinfiltration tilnærming som presenteres her kan mye være knyttet til et bredt spekter av plante virus. Et kjennetegn trekk ved denne tilnærmingen er synkronisert levering av flere agroconstruct til samme celle-en stor ulempe vanligvis forbindes med rutinemessig brukes mekanisk inokulering av plante virus. In vivo og de vitro montering studier med brome mosaic virus som modell kan gjennomføres effektivt ved Følgende noen tips. (i) for vellykket infiltrasjon av N. benthamiana forlater i…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke flere medlemmer av lab for sine verdifulle innspill i utviklingen av agroinfiltration og in vitro montering analyser. Dette arbeidet ble finansiert av et stipend fra University of California. Denne studien ble støttet i deler av et stipend fra National Science Foundation (CBET-1144237).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| MES Sodium salts | Sigma-aldrich | M2993 |
| Indocyanine green | Sigma-aldrich | I2633 |
| Beckman ultracentrifuge | Beckman Coulter | Model: L8-70M |
| Centricon-100 column | Millipore | YM-100 |
| Spectrophotometer | Cary 50, Varian Inc. | Part number 10068900 |
| Spectrofluorometer | Fluorolog 3, Jobin-Yvon. | Part number FL3-21 |
References
- Annamalai, P., Rao, A. L. Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging. Virology. 338, 96-111 (2005).
- Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration. J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).
- Annamalai, P., Rao, A. L., Foster, N., Johansen, H. . Plant Virology Protocols. 451, 251-264 (2008).
- Lane, L. C. The bromoviruses. Adv. Virus Res. 19, 151-220 (1974).
- Choi, Y. G., Rao, A. L. Molecular studies on bromovirus capsid protein. VII. Selective packaging on BMV RNA4 by specific N-terminal arginine residuals. Virology. 275, 207-217 (2000).
- Sambrrok, J., Russel, D. W. . Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (2001).
- Dreher, T. W., Rao, A. L., Hall, T. C. Replication in vivo of mutant brome mosaic virus RNAs defective in aminoacylation. J. Mol. Biol. 206, 425-438 (1989).
- Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications. A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).
- Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103, 157-167 (2000).
- Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
