Silke filmene er en roman klasse av biomaterialer lett tilpasses for en rekke biomedisinske applikasjoner. Den presenterte silke filmkultur system er svært tilpasningsdyktig til en rekke<em> In vitro</em> Analyser. Dette systemet representerer en biomateriale utforming plattformen, og gir<em> In vitro</em> Optimalisering før direkte oversettelse til<em> In vivo</em> Modeller.
Silke filmer er lovende protein-baserte biomaterialer som kan fabrikkert med high fidelity og økonomisk innenfor et forskningslaboratorium miljø 1,2. Disse materialene er ønskelig fordi de besitter svært kontrollerbare dimensjonale og materielle egenskaper, er biokompatibelt og fremme celle adhesjon, kan endres gjennom topografisk mønster eller ved kjemisk endre overflaten, og kan brukes som et depot for biologisk aktive molekyler for levering av legemidler relaterte programmer 3-8. I tillegg silke filmer er relativt enkelt å spesialtilpasse, kan være konstruert for å løse opp i løpet av minutter eller brytes ned over år i vitro eller in vivo, og produserer med den ekstra fordelen av å være gjennomsiktig i naturen og derfor godt egnet for bildebehandlingsprogrammer 9 – 13. Kulturen Systemet metodikken presenteres her representerer en skalerbar tilnærming for raske vurderinger av celle-silke film overflateinteraksjoner. Av spesiell interesse er bruk av overflaten mønstrede silke filmer å studere forskjeller i celleproliferasjon og svarene av celler for justering 12,14. De seeded kulturer ble dyrket på både mikro-mønstrede og flate silke film underlag, og deretter vurderes gjennom tid-lapse fase-kontrast bildebehandling, scanning elektron mikroskopi, og biokjemiske vurdering av metabolsk aktivitet og nukleinsyre innhold. I sammendraget, tilbyr silke filmen in vitro kultur systemet en passelig eksperimentell oppsett egnet til studier av celle-overflate interaksjoner på en biomateriale underlaget, som deretter kan optimaliseres, og deretter oversatt til in vivo modeller. Observasjoner ved hjelp av kultur-systemet presenteres her blir for tiden brukt til å hjelpe i applikasjoner som spenner fra grunnleggende celle interaksjoner til medisinsk apparat design, og dermed er relevant for et bredt spekter av biomedisinske områder.
Bruken av regenerert silke filmer som underlag for cellekultur har fått i popularitet de siste to tiårene på grunn av omfattende karakterisering av materialegenskaper av dette proteinet og økt forståelse av dens biomateriale nytte 3,8. Kulturen systemet beskrevet her representerer en roman in vitro testing system for vurdering av celleoverflaten interaksjoner på mønstret silke film biomateriale underlag 7. Systemet gir mulighet for grundig analyse av cellulære interaksjoner over tid som kan være lett vedtatt for høy gjennomstrømning datainnsamling. Dette er i stor grad aktivert, fordi silke filmer har en rekke tunbare biomateriale egenskaper som kan endres for å direkte påvirke celle funksjon 8,9,12, inkludert: kontroll av overflate mikro / nano-overflatetopografi 7; ulike overflate kjemi gjennom kovalent modifisering eller adsorpsjon av biologisk aktive molekyler 13; robust mechanical eiendommer 15,16; kontroll av materiale hydrophilicity / hydrofobisitet 16; ilegging av biologiske forbindelser for utgivelse 4,8,17, og kontrollert oppløsning / enzymatisk nedbrytning priser gjennom kontroll av den sekundære struktur (beta ark innhold) 11,18,19 .
Gjennomsiktigheten av silke filmer oppnås gjennom annealing filmene for en periode under vakuum i nærvær av vanndamp 7,15. Denne behandlingen tilnærmingen åpner for dannelsen av β-ark sekundær struktur, fremme insolubility av materialet i vannet samtidig som minimal diffraksjon av lys 15. Denne åpenhet filmer er nøkkelen i muliggjør direkte live-celle bildebehandling som kan være ansatt under en rekke bildediagnostikk (dvs. bredt felt og fluorescens) ved hjelp av en rekke av mikroskop systemer 12,20. I tillegg til live-celle bildebehandling, kan silke filmer enkelt fjernes fra the kultur system for å tillate ytterligere fiksering og analyse. Dermed blir stort utvalg av direkte eksperimentelle vurderinger som kan utføres på dette systemet gjelder for et bredt spekter av celle / vev kilder for mange tekniske felt 3,8,9,12,13,21. De time-lapse imaging resultater illustrere hvordan sanntidsdata kultur data kan samles, og som et eksempel ble utnyttet for å illustrere hvordan overflatetopografi påvirker celle interaksjoner. De representative Resultatene viser hvordan silke film biomaterialer kan brukes til å støtte HCLE kultur vekst, og er amendable til en rekke standard celleproliferasjonstest og metabolske analyser (Fig. 4). I tillegg er kulturen fast og behandlet for scanning elektronmikroskop avbildning eller andre protokoller (Fig. 3).
Silke film substrater er produsert i laboratoriet med high fidelity, konsistens, og med relativt lave kostnader (Fig. 1). Dette gjør reproduciansvar i både kultur systemoppsettet og eksperimentelle resultater. Det er vist at vann-anneal prosessering gir et stabilt silke filmmateriale innenfor kultur som har definert Nedbrytingshastigheten påvente konsentrasjonen av proteaser i løsning 2,15,22. Som et resultat av disse materialene kan brukes i lengre perioder for langsiktig cellekultur, eller forbli implantert i måneder eller år, avhengig av fysiologisk plassering åtte. I tillegg har nyere arbeid vist at både protein struktur og materialegenskaper av vann-glødet silke filmer er konsistent fra parti til parti som åpner for reproduserbare kultur resultater som vist gjennom ulike mekaniske og biofysisk testmetoder 15,16. I tillegg har materialet overflate vist stor trofasthet blant film batcher som indikert av SEM, atomic force micrscopy (AFM), og cellekultur studier {Lawrence: 2008wr, Omenetto: 2008tc, Bray: 2011kq} 7,23,24. Materiale stabilligheten og konsistens er en viktig faktor for hvordan cellen vil kjenne kulturen underlaget gjennom de ulike mechanotransduction veier, og til slutt produsere en ønsket / uønsket cellulær respons 25,26.
Historiske standarder for kultur underlag, for eksempel vev kultur behandlet plast eller glass, gir tilstrekkelige underlag for celle vedlegg. Men disse materialene er ikke amendable for ytterligere nytte in vivo. Det kan så for seg at en silke film biomateriale kunne tilpasses in vitro, og en gang eksperimentelle forventninger har oppnådd den tilpassede filmen kan være direkte oversatt til en in vivo modell. Slik paret utforming mellom in vitro og in vivo eksperimenter tilbyr en stor fordel for slike implanterbare silke biomaterialer over andre underlag som rutinemessig brukes in vitro.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering fra K08EY015829 NIH, R21EY019561, R24EY015656, P41 EB002520, og R01 EY020856 Forskning for å hindre blindhet Career Development Award, og Tri-institusjonelle Stem Cell Initiative. HCLE cellelinje gitt courtesy of Dr. Ilene Gipson. Forfatterne ønsker å takke dr. Aihong Liu ved Weill Cornell Medical College for henne teknisk assistanse og veiledning med cellekulturer, Anthony Labissiere ved Hospital for Spesielle Operasjoner for henne teknisk assistanse med SEM bildebehandling, den Tissue Engineering Resource Center (TERC) ved Tufts University for teknisk støtte med materiell utvikling, og Cornell Center for nanoskala Science and Technology Facility (CNF) for å få hjelp i silisium wafer produksjon.
Material Name | Company | Catalogue Number |
Silk cocoons | Tajima Shoji Co., LTD. | NA |
PDMS monomer and cross-linker | Momentive | RTV615A 01P |
Sodium Carbonate | Sigma | S2127 |
Lithium Bromide | Sigma | 213225 |
Slide-A-Lyzer | Thermo Scientific | 66110 |
1 mL Syringe | Becton-Dickenson | 309602 |
Stainless steel washer | Superior Washer | 81610 |
24-well plate | VWR | 353047 |