Isolation vampirique de fluide extracellulaire d'<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
L'organisme modèle<em> C. elegans</em> Utilise un fluide pseudocoelomic comme un système circulatoire passive. Dosage direct de ce fluide n'a pas été possible auparavant. Ici, nous présentons une nouvelle technique pour analyse directement l'espace extracellulaire, et utiliser les signaux silencieux systémiques lors d'une réponse ARNi comme une preuve de principe par exemple.
Abstract
Le maïs génétiquement docile organisme modèle C. elegans a fourni des indications sur une multitude de questions biologiques, a permis par son temps de génération court, la facilité de croissance et de petite taille. Cette petite taille, cependant, a refusé un certain nombre d'approches techniques trouvées dans des systèmes modèles d'autres. Par exemple, les transfusions sanguines dans les systèmes mammaliens et des techniques de greffage dans les plantes permettent de poser des questions de composition du système circulatoire et de signalisation. Le système circulatoire du ver, le pseudocoelom, a été jusqu'à récemment impossible de doser directement. Pour répondre aux questions de signalisation intercellulaire et le système circulatoire composition C. chercheurs elegans ont traditionnellement recours à l'analyse génétique, cellulaire / tissulaire spécifique de sauvetage, et l'analyse de la mosaïque. Ces techniques fournissent un moyen pour déduire ce qui se passe entre les cellules, mais ne sont pas universellement applicable dans l'identification et la caractérisation des molécules extracellulaires. Nous présentons ici un newly technique mis au point pour doser le fluide directement pseudocoelomic de C. elegans. La technique commence soit par manipulation génétique ou physique pour augmenter le volume de fluide extracellulaire. Ensuite, les animaux sont soumis à une technique de micro-injection vampirique inverse en utilisant une plate-forme de micro-injection qui permet bien de commande de pression d'équilibre. Après isolement du liquide extracellulaire, le liquide recueilli peut être analysée par transfert dans d'autres animaux ou par des moyens moléculaires. Pour démontrer l'efficacité de cette technique, nous présentons une approche détaillée pour doser un exemple spécifique de molécules de signalisation extracellulaire, à long ARN double brin lors d'une réponse systémique ARNi. Bien que la caractérisation de RNAi systémique est une preuve de principe par exemple, nous voyons cette technique comme étant adaptable pour répondre à une variété de questions de la composition du système circulatoire et la signalisation.
Protocol
Discussion
Nous avons présenté ici une nouvelle méthode qui permet l'isolement et la caractérisation des liquides extracellulaires de l'organisme modèle C. elegans. La technique commence par la manipulation génétique ou physique de vers donateurs à accroître leur volume total du liquide extracellulaire. Fluide extracellulaire est ensuite isolé en utilisant une technique de micro-injection modifiée. Les vers sont montés pour la micro-injection à l'aide d'agarose tampons secs pour emprisonner le…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à souligner la nature collaborative du laboratoire de Hunter, et les remercier pour le débat utile et d'assistance qui fait du développement de cette technique possible et amusant. Nous tenons à remercier Nigel Delaney et le Caenorhabditis Genetics Center for ver et souches bactériennes. Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé GM089795 subvention à CPH.
Materials
| Day | Worm Prep | Material Prep |
| -7 or prior | Maintain clean, well fed clr-1(e1745) and N2 worms | Make injection pads, NGM plates, NGM +Carb/IPTG plates, OP50 LB stock |
| -6 | Streak out RNAi food on LB + Carb | |
| -5 | Inoculate 3 mL overnight with RNAi food | |
| -4 | Move embryos to RNAi plate | Seed RNAi plate |
| -3 | ||
| -2 | ||
| -1 | ||
| 0 | Shift worms to 25 for 4 hours | Make assay plates |
| Move worms to clean NGM plates | ||
| Vampiric transfer | ||
| Recover recipient | ||
| +1 | Remove transfer recipient | |
| +2 | Score Progeny |
Table 1. Material preparation timeline.
| Equipment | Company | Catalogue number |
| Picoliter Pressure Injector | Warner Instruments | 65-0001 (PLI-100) |
| Flaming/Brown micropipette Puller | Sutter Instruments | P97 |
| Axiovert 200 | Zeiss | |
| Reagents | ||
| Mineral Oil | EM Science | MX1560-1 |
| 22×50 no 1½ Cover Glass | Corning | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precisions Instruments | 1B100F-4 |
| Sodium Hypochlorite Solution (5% available Chlorine) | J.T. Baker | 9416-01 |
| C. elegans and Bacterial Strains | ||
| clr-1(e1745)II 9 | The Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | CB3241 |
| glp-1 RNAi vector 10 | Source Bioscience (Ahringer Feeding Library) | F02A9.6 |
| pal-1 RNAi vector11 | pHC187 | |
| OP50-GFP 5 | The Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50-GFP |
| YFP E. coli 4 | MC4100-YFP | |
Table 2. Specific reagents and equipment.
References
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