בידוד ערפדים של נוזלים מתאיים<em> Elegans Caenorhabditis</em
Summary
אורגניזם המודל<em> ג elegans</em> משתמש בנוזל pseudocoelomic כמערכת דם פסיבית. בדיקה ישירה של הנוזל הזה לא הייתה אפשרית בעבר. כאן אנו מציגים שיטה חדשנית לבדיקה ישירות חלל החוץ התאי, ולהשתמש באותות השתקה מערכתיים בתגובת RNAi כהוכחה לדוגמא עיקרון.
Abstract
המודל גנטי הצייתן האורגניזם ג elegans ספק תובנה לתוך מספר עצום של שאלות ביולוגיות, מופעל על ידי זמן הדור הקצר שלו, קלויות גידול וגודל קטן. גודל קטן זה, אם כי, לא מרשה מספר גישות טכניות שנמצאו במערכות מודל אחרות. לדוגמה, עירויי דם במערכות יונקים וטכניקות השתלה בצמחים מאפשרים לשאול שאלות של הרכב דם ומערכת איתות. מערכת הדם של התולעת, pseudocoelom, יש לו עד לאחרונה היה בלתי אפשרי לבדיקה באופן ישיר. כדי לענות על שאלות של איתות אינטר ומערכת דם ההרכב ג חוקרי elegans הפכו באופן מסורתי לניתוח גנטי, הצלה ספציפית תא / רקמה, וניתוח פסיפס. טכניקות אלה מספקות אמצעים להסיק מה שקורה בין תאים, אך אינן ישימים באופן אוניברסלי בזיהוי ואפיון של מולקולות תאיות. כאן אנו מציגים neטכניקה שפותחה wly ישירות assay נוזל pseudocoelomic של ג elegans. הטכניקה מתחילה עם או מניפולציה גנטית או פיזית כדי להגדיל את נפח נוזל חוץ תאי. אחר כך את בעלי חי נתונים לטכניקת microinjection הפוך ערפדים באמצעות אסדת microinjection המאפשרת שליטה בלחץ איזון עדינה. לאחר הבידוד של נוזל חוץ תאי, הנוזל נאסף ניתן assayed על ידי העביר לבעלי חיים אחרים או באמצעים מולקולריים. כדי להדגים את היעילות של טכניקה זו אנו מציגים גישה מפורטת לassay דוגמה ספציפית של מולקולות איתות תאיות, dsRNA הארוך במהלך תגובת RNAi מערכתית. למרות אפיון של RNAi המערכתי הוא הוכחה לדוגמא עיקרון, אנו רואים בטכניקה זו כישים לענות על מגוון שאלות של קומפוזיציה ואיתות מערכת דם.
Protocol
Discussion
יש לנו הצגנו שיטה חדשה המאפשרת בידוד והאפיון של נוזל חוץ תאי ממודל אורגניזם ג כאן elegans. הטכניקה מתחילה במניפולציה הגנטית או פיזית של תולעים תורמים להגדלת הנפח הכולל של נוזל חוץ התאי שלהם. אז נוזל חוץ תאי הוא מבודד בטכניקת microinjection שונה. התולעים הם רכובים על micr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להכיר את האופי השיתופי של האנטר המעבדה, ומודה להם על דיון וסיוע המועיל שעשה פיתוח של טכניקה זו אפשרית ומהנה. ברצוננו להודות לנייג'ל דילייני וCaenorhabditis גנטיקת המרכז לתולעת וזני חיידקים. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות GM089795 מענק לCPH.
Materials
| Day | Worm Prep | Material Prep |
| -7 or prior | Maintain clean, well fed clr-1(e1745) and N2 worms | Make injection pads, NGM plates, NGM +Carb/IPTG plates, OP50 LB stock |
| -6 | Streak out RNAi food on LB + Carb | |
| -5 | Inoculate 3 mL overnight with RNAi food | |
| -4 | Move embryos to RNAi plate | Seed RNAi plate |
| -3 | ||
| -2 | ||
| -1 | ||
| 0 | Shift worms to 25 for 4 hours | Make assay plates |
| Move worms to clean NGM plates | ||
| Vampiric transfer | ||
| Recover recipient | ||
| +1 | Remove transfer recipient | |
| +2 | Score Progeny |
Table 1. Material preparation timeline.
| Equipment | Company | Catalogue number |
| Picoliter Pressure Injector | Warner Instruments | 65-0001 (PLI-100) |
| Flaming/Brown micropipette Puller | Sutter Instruments | P97 |
| Axiovert 200 | Zeiss | |
| Reagents | ||
| Mineral Oil | EM Science | MX1560-1 |
| 22×50 no 1½ Cover Glass | Corning | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precisions Instruments | 1B100F-4 |
| Sodium Hypochlorite Solution (5% available Chlorine) | J.T. Baker | 9416-01 |
| C. elegans and Bacterial Strains | ||
| clr-1(e1745)II 9 | The Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | CB3241 |
| glp-1 RNAi vector 10 | Source Bioscience (Ahringer Feeding Library) | F02A9.6 |
| pal-1 RNAi vector11 | pHC187 | |
| OP50-GFP 5 | The Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50-GFP |
| YFP E. coli 4 | MC4100-YFP | |
Table 2. Specific reagents and equipment.
References
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833-e833 (2008).
- Hirose, T., Nakano, Y., Nagamatsu, Y., Misumi, T., Ohta, H., Ohshima, Y. Cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 controls body size and lifespan in C elegans. Development. 130, 1089-1099 (2003).
- Kimble, J. Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 87, 286-300 (1981).
- Hegreness, M., Shoresh, N., Hartl, D., Kishony, R. An equivalence principle for the incorporation of favorable mutations in asexual populations. Science. 311, 1615-1617 (2006).
- Labrousse, A., Chauvet, S., Couillault, C., Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Caenorhabditis elegans is a model host for Salmonella typhimurium. Curr. Biol. 10, 1543-1545 (2000).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome. Biol. 2, (2001).
- Min, K., Kang, J., Lee, J. A modified feeding RNAi method for simultaneous knock-down of more than one gene in Caenorhabditis elegans. Biotechniques. 48, 229-232 (2010).
- Zhuang, J. J., Hunter, C. P. Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans Enhanced RNAi Mutants. Génétique. 188 (1), 235-237 (2011).
- Way, J. C., Chalfie, M. mec-3, a homeobox-containing gene that specifies differentiation of the touch receptor neurons in C. elegans. Cell. 54, 5-16 (1988).
- Kamath, R. S., Fraser, A. G., Dong, Y., Poulin, G., Durbin, R., Gotta, M., Kanapin, A., Bot, N. L. e., Moreno, S., Sohrmann, M. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295, 2456-2459 (2002).
