Isolamento del Vampiro di liquido extracellulare da<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
Il modello di organismo<em> C. elegans</em> Utilizza fluido pseudocoelomic come sistema circolatorio passiva. Saggio diretto di questo fluido non è stato possibile in precedenza. Qui presentiamo una nuova tecnica per direttamente dosaggio spazio extracellulare, e utilizzare segnali silenziamento sistemici durante una risposta RNAi come prova di principio esempio.
Abstract
Il modello di organismo geneticamente trattabili C. elegans ha fornito dei chiarimenti in una miriade di questioni biologiche, attivata per il suo tempo di generazione breve, la facilità di crescita e di piccole dimensioni. Questa piccola dimensione, però, è non riconosciute una serie di approcci tecnici che si trovano in altri sistemi modello. Ad esempio, le trasfusioni di sangue nei sistemi di mammiferi e le tecniche di innesto delle piante consentono domande di composizione del sistema circolatorio e di segnalazione. Il sistema circolatorio del worm, il pseudoceloma, finora è stato impossibile per il dosaggio direttamente. Per rispondere alle domande di segnalazione intercellulare e circolatorio sistema di composizione C. elegans ricercatori hanno tradizionalmente rivolto a un'analisi genetica, cellule / tessuti soccorso specifico e analisi mosaico. Queste tecniche forniscono un mezzo per inferire ciò che avviene tra le cellule, ma non sono universalmente applicabili identificazione e caratterizzazione di molecole extracellulari. Qui vi presentiamo una newly tecnica sviluppata per dosaggio direttamente il fluido pseudocoelomic di C. elegans. La tecnica inizia con uno manipolazione genetica o fisica per aumentare il volume di fluido extracellulare. Successivamente gli animali sono sottoposti ad una tecnica di microiniezione vampirica inversa usando un'attrezzatura microiniezione che permette il controllo della pressione ammenda equilibrio. Dopo l'isolamento del fluido extracellulare, il fluido raccolto può essere saggiata mediante trasferimento in altri animali o per mezzo molecolari. Per dimostrare l'efficacia di questa tecnica presentiamo un approccio dettagliato per analizzare un esempio specifico di molecole segnale extracellulari, dsRNA lungo durante una risposta sistemica RNAi. Anche se la caratterizzazione di RNAi sistemica è una prova di principio esempio, vediamo come questa tecnica adattabile a rispondere a una serie di domande di composizione del sistema circolatorio e di segnalazione.
Protocol
Discussion
Abbiamo qui presentato un nuovo metodo che permette l'isolamento e la caratterizzazione di liquido extracellulare dal modello dell'organismo C. elegans. La tecnica inizia con la manipolazione genetica o fisica di vermi donatori di aumentare il volume totale di fluido extracellulare. Liquido extracellulare è quindi isolato utilizzando una tecnica di microiniezione modificato. I vermi sono montati a secco per microiniezione utilizzando tamponi agarosio per tenere i vermi ancora durante la procedura. L…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo riconoscere la natura collaborativa del laboratorio Hunter, e li ringrazio per la discussione è stata utile e l'assistenza che ha reso lo sviluppo di questa tecnica possibile e divertente. Vorremmo ringraziare Nigel Delaney e il Caenorhabditis Genetica Centro per la vite senza fine e ceppi batterici. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health GM089795 sovvenzione CPH.
Materials
| Day | Worm Prep | Material Prep |
| -7 or prior | Maintain clean, well fed clr-1(e1745) and N2 worms | Make injection pads, NGM plates, NGM +Carb/IPTG plates, OP50 LB stock |
| -6 | Streak out RNAi food on LB + Carb | |
| -5 | Inoculate 3 mL overnight with RNAi food | |
| -4 | Move embryos to RNAi plate | Seed RNAi plate |
| -3 | ||
| -2 | ||
| -1 | ||
| 0 | Shift worms to 25 for 4 hours | Make assay plates |
| Move worms to clean NGM plates | ||
| Vampiric transfer | ||
| Recover recipient | ||
| +1 | Remove transfer recipient | |
| +2 | Score Progeny |
Table 1. Material preparation timeline.
| Equipment | Company | Catalogue number |
| Picoliter Pressure Injector | Warner Instruments | 65-0001 (PLI-100) |
| Flaming/Brown micropipette Puller | Sutter Instruments | P97 |
| Axiovert 200 | Zeiss | |
| Reagents | ||
| Mineral Oil | EM Science | MX1560-1 |
| 22×50 no 1½ Cover Glass | Corning | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precisions Instruments | 1B100F-4 |
| Sodium Hypochlorite Solution (5% available Chlorine) | J.T. Baker | 9416-01 |
| C. elegans and Bacterial Strains | ||
| clr-1(e1745)II 9 | The Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | CB3241 |
| glp-1 RNAi vector 10 | Source Bioscience (Ahringer Feeding Library) | F02A9.6 |
| pal-1 RNAi vector11 | pHC187 | |
| OP50-GFP 5 | The Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50-GFP |
| YFP E. coli 4 | MC4100-YFP | |
Table 2. Specific reagents and equipment.
References
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833-e833 (2008).
- Hirose, T., Nakano, Y., Nagamatsu, Y., Misumi, T., Ohta, H., Ohshima, Y. Cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 controls body size and lifespan in C elegans. Development. 130, 1089-1099 (2003).
- Kimble, J. Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 87, 286-300 (1981).
- Hegreness, M., Shoresh, N., Hartl, D., Kishony, R. An equivalence principle for the incorporation of favorable mutations in asexual populations. Science. 311, 1615-1617 (2006).
- Labrousse, A., Chauvet, S., Couillault, C., Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Caenorhabditis elegans is a model host for Salmonella typhimurium. Curr. Biol. 10, 1543-1545 (2000).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome. Biol. 2, (2001).
- Min, K., Kang, J., Lee, J. A modified feeding RNAi method for simultaneous knock-down of more than one gene in Caenorhabditis elegans. Biotechniques. 48, 229-232 (2010).
- Zhuang, J. J., Hunter, C. P. Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans Enhanced RNAi Mutants. Génétique. 188 (1), 235-237 (2011).
- Way, J. C., Chalfie, M. mec-3, a homeobox-containing gene that specifies differentiation of the touch receptor neurons in C. elegans. Cell. 54, 5-16 (1988).
- Kamath, R. S., Fraser, A. G., Dong, Y., Poulin, G., Durbin, R., Gotta, M., Kanapin, A., Bot, N. L. e., Moreno, S., Sohrmann, M. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295, 2456-2459 (2002).
