Vampiric Aislamiento de líquido extracelular de<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
El organismo modelo<em> C. elegans</em> Utiliza fluido pseudocoelomic como un sistema circulatorio pasiva. Ensayo directo de este fluido no ha sido posible anteriormente. Aquí se presenta una técnica novedosa de ensayo directamente en el espacio extracelular, y utilizar las señales sistémicas silenciamiento durante una respuesta de RNAi como una prueba de principio ejemplo.
Abstract
El organismo genéticamente tractable modelo C. elegans ha ayudado a comprender un gran número de cuestiones biológicas, habilitado por su corto tiempo de generación, facilidad de crecimiento y el tamaño pequeño. Este pequeño tamaño, sin embargo, ha rechazado un número de enfoques técnicos encontrados en otros sistemas modelo. Por ejemplo, las transfusiones de sangre en los sistemas de mamíferos y las técnicas de injerto en plantas permiten hacer preguntas de composición del sistema circulatorio y señalización. El sistema circulatorio de la lombriz, el pseudoceloma, ha sido hasta hace poco imposible de ensayo directamente. Para responder a las preguntas de la señalización intercelular y el sistema circulatorio composición C. investigadores elegans tradicionalmente han convertido a un análisis genético, de célula / tejido de rescate específico, y el análisis de mosaico. Estas técnicas proporcionan un medio para inferir lo que está pasando entre las células, pero no son universalmente aplicables en la identificación y caracterización de moléculas extracelulares. Aquí les presentamos una neWLY técnica desarrollada a ensayo directamente el fluido pseudocoelomic de C. elegans. La técnica comienza con cualquiera de manipulación genética o física para aumentar el volumen de fluido extracelular. Después, los animales se someten a una técnica de microinyección vampírica inversa usando una plataforma de microinyección que permite un control fino balance de la presión. Después del aislamiento de fluido extracelular, el líquido recogido puede ensayarse por transferencia a otros animales o por medios moleculares. Para demostrar la eficacia de esta técnica se presenta un enfoque detallado para el ensayo de un ejemplo específico de moléculas de señalización extracelular, durante un largo dsRNA de respuesta RNAi. Aunque la caracterización de RNAi sistémico es una prueba de principio ejemplo, vemos esta técnica como ser adaptable para responder una variedad de preguntas de la composición del sistema circulatorio y de señalización.
Protocol
Discussion
Hemos presentado aquí un nuevo método que permite el aislamiento y la caracterización de líquido extracelular del organismo modelo C. elegans. La técnica comienza con la manipulación genética o física de gusanos donantes a incrementar su volumen total de fluido extracelular. Fluido extracelular se aísla a continuación usando una técnica de microinyección modificada. Los gusanos están montados para la microinyección usando almohadillas secas de agarosa para mantener los gusanos inmóvil durante el …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría reconocer la naturaleza de colaboración del laboratorio de Hunter, y darles las gracias por el debate útil y la asistencia que han hecho del desarrollo de esta técnica posible y divertido. Nos gustaría dar las gracias a Nigel Delaney y el Caenorhabditis Centro de Genética para el gusano y las cepas bacterianas. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención GM089795 a CPH.
Materials
| Day | Worm Prep | Material Prep |
| -7 or prior | Maintain clean, well fed clr-1(e1745) and N2 worms | Make injection pads, NGM plates, NGM +Carb/IPTG plates, OP50 LB stock |
| -6 | Streak out RNAi food on LB + Carb | |
| -5 | Inoculate 3 mL overnight with RNAi food | |
| -4 | Move embryos to RNAi plate | Seed RNAi plate |
| -3 | ||
| -2 | ||
| -1 | ||
| 0 | Shift worms to 25 for 4 hours | Make assay plates |
| Move worms to clean NGM plates | ||
| Vampiric transfer | ||
| Recover recipient | ||
| +1 | Remove transfer recipient | |
| +2 | Score Progeny |
Table 1. Material preparation timeline.
| Equipment | Company | Catalogue number |
| Picoliter Pressure Injector | Warner Instruments | 65-0001 (PLI-100) |
| Flaming/Brown micropipette Puller | Sutter Instruments | P97 |
| Axiovert 200 | Zeiss | |
| Reagents | ||
| Mineral Oil | EM Science | MX1560-1 |
| 22×50 no 1½ Cover Glass | Corning | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precisions Instruments | 1B100F-4 |
| Sodium Hypochlorite Solution (5% available Chlorine) | J.T. Baker | 9416-01 |
| C. elegans and Bacterial Strains | ||
| clr-1(e1745)II 9 | The Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | CB3241 |
| glp-1 RNAi vector 10 | Source Bioscience (Ahringer Feeding Library) | F02A9.6 |
| pal-1 RNAi vector11 | pHC187 | |
| OP50-GFP 5 | The Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50-GFP |
| YFP E. coli 4 | MC4100-YFP | |
Table 2. Specific reagents and equipment.
References
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833-e833 (2008).
- Hirose, T., Nakano, Y., Nagamatsu, Y., Misumi, T., Ohta, H., Ohshima, Y. Cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 controls body size and lifespan in C elegans. Development. 130, 1089-1099 (2003).
- Kimble, J. Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 87, 286-300 (1981).
- Hegreness, M., Shoresh, N., Hartl, D., Kishony, R. An equivalence principle for the incorporation of favorable mutations in asexual populations. Science. 311, 1615-1617 (2006).
- Labrousse, A., Chauvet, S., Couillault, C., Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Caenorhabditis elegans is a model host for Salmonella typhimurium. Curr. Biol. 10, 1543-1545 (2000).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome. Biol. 2, (2001).
- Min, K., Kang, J., Lee, J. A modified feeding RNAi method for simultaneous knock-down of more than one gene in Caenorhabditis elegans. Biotechniques. 48, 229-232 (2010).
- Zhuang, J. J., Hunter, C. P. Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans Enhanced RNAi Mutants. Génétique. 188 (1), 235-237 (2011).
- Way, J. C., Chalfie, M. mec-3, a homeobox-containing gene that specifies differentiation of the touch receptor neurons in C. elegans. Cell. 54, 5-16 (1988).
- Kamath, R. S., Fraser, A. G., Dong, Y., Poulin, G., Durbin, R., Gotta, M., Kanapin, A., Bot, N. L. e., Moreno, S., Sohrmann, M. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295, 2456-2459 (2002).
