Vampyriska Isolering av extracellulär vätska från<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
Modellen organismen<em> C. elegans</em> Använder pseudocoelomic vätska som en passiv cirkulationssystemet. Direkt analys av denna vätska har inte varit möjligt tidigare. Här presenterar vi en ny teknik för att direkt analysera extracellulära utrymmet, och använda systemiska tystande signaler under en RNAi svar som ett bevis på principiellt exempel.
Abstract
Den genetiskt lätthanterlig modellorganism C. elegans har gett insikt i en myriad av biologiska frågor, aktiveras av sin korta generationstid, enkel tillväxt och liten storlek. Den lilla storleken, men har förbjudit ett antal tekniska metoder finns i andra modellsystem. Till exempel möjliggör blodtransfusioner i däggdjur system och ympning teknik i växter ställa frågor cirkulationssystemet sammansättning och signalering. Cirkulationssystemet hos masken, det pseudocoelom, har tills nyligen varit omöjligt att direkt analys. Att svara på frågor om intercellulär signalering och cirkulationssystemet sammansättning C. elegans forskare har traditionellt vänt sig till genetisk analys, celler / vävnader specifik räddning och mosaik analys. Dessa tekniker ger ett medel för att sluta sig vad som händer mellan celler, men är inte allmänt tillämpliga vid identifiering och karakterisering av extracellulära molekyler. Här presenterar vi en newly utvecklad teknik för att direkt analysera vätskan pseudocoelomic av C. elegans. Tekniken börjar med antingen genetisk eller fysisk manipulation för att öka volymen av extracellulär vätska. Efteråt djuren utsätts för en vampyriska omvänd mikroinjektion teknik med hjälp av en mikroinjektion rigg som gör finjustering balans tryck. Efter isolering av extracellulär vätska, kan den uppsamlade vätskan analyseras genom överföring till andra djur eller genom molekylära medel. För att demonstrera effektiviteten av denna teknik presenterar vi en detaljerad strategi för att analysera ett specifikt exempel på extracellulära signalmolekyler, lång dsRNA under en systemisk RNAi svar. Även karakterisering av systemisk RNAi är ett bevis på principen exempel ser vi denna teknik som anpassas för att svara på en rad olika frågor om cirkulationssystemet sammansättning och signalering.
Protocol
Discussion
Vi har presenterat här en ny metod som möjliggör isolering och karakterisering av extracellulär vätska från modellorganism C. elegans. Tekniken börjar med genetisk eller fysisk manipulation av donator maskar att öka sin totala volymen av extracellulär vätska. Extracellulär vätska isoleras sedan med hjälp av en modifierad mikroinjektion teknik. Masken är monterade för mikroinjektion med torra agaros kuddar att hålla maskar fortfarande under förfarandet. Den fysiska fastsättning på plattan anv?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka för det samarbete natur Hunter Lab, och tacka dem för den hjälpsamma diskussioner och hjälp som gjorde utvecklingen av denna teknik är möjligt och roligt. Vi vill tacka Nigel Delaney och Caenorhabditis genetik Centrum för masken och bakteriestammar. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health GM089795 bidrag till CPH.
Materials
| Day | Worm Prep | Material Prep |
| -7 or prior | Maintain clean, well fed clr-1(e1745) and N2 worms | Make injection pads, NGM plates, NGM +Carb/IPTG plates, OP50 LB stock |
| -6 | Streak out RNAi food on LB + Carb | |
| -5 | Inoculate 3 mL overnight with RNAi food | |
| -4 | Move embryos to RNAi plate | Seed RNAi plate |
| -3 | ||
| -2 | ||
| -1 | ||
| 0 | Shift worms to 25 for 4 hours | Make assay plates |
| Move worms to clean NGM plates | ||
| Vampiric transfer | ||
| Recover recipient | ||
| +1 | Remove transfer recipient | |
| +2 | Score Progeny |
Table 1. Material preparation timeline.
| Equipment | Company | Catalogue number |
| Picoliter Pressure Injector | Warner Instruments | 65-0001 (PLI-100) |
| Flaming/Brown micropipette Puller | Sutter Instruments | P97 |
| Axiovert 200 | Zeiss | |
| Reagents | ||
| Mineral Oil | EM Science | MX1560-1 |
| 22×50 no 1½ Cover Glass | Corning | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precisions Instruments | 1B100F-4 |
| Sodium Hypochlorite Solution (5% available Chlorine) | J.T. Baker | 9416-01 |
| C. elegans and Bacterial Strains | ||
| clr-1(e1745)II 9 | The Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | CB3241 |
| glp-1 RNAi vector 10 | Source Bioscience (Ahringer Feeding Library) | F02A9.6 |
| pal-1 RNAi vector11 | pHC187 | |
| OP50-GFP 5 | The Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50-GFP |
| YFP E. coli 4 | MC4100-YFP | |
Table 2. Specific reagents and equipment.
References
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833-e833 (2008).
- Hirose, T., Nakano, Y., Nagamatsu, Y., Misumi, T., Ohta, H., Ohshima, Y. Cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 controls body size and lifespan in C elegans. Development. 130, 1089-1099 (2003).
- Kimble, J. Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 87, 286-300 (1981).
- Hegreness, M., Shoresh, N., Hartl, D., Kishony, R. An equivalence principle for the incorporation of favorable mutations in asexual populations. Science. 311, 1615-1617 (2006).
- Labrousse, A., Chauvet, S., Couillault, C., Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Caenorhabditis elegans is a model host for Salmonella typhimurium. Curr. Biol. 10, 1543-1545 (2000).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome. Biol. 2, (2001).
- Min, K., Kang, J., Lee, J. A modified feeding RNAi method for simultaneous knock-down of more than one gene in Caenorhabditis elegans. Biotechniques. 48, 229-232 (2010).
- Zhuang, J. J., Hunter, C. P. Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans Enhanced RNAi Mutants. Génétique. 188 (1), 235-237 (2011).
- Way, J. C., Chalfie, M. mec-3, a homeobox-containing gene that specifies differentiation of the touch receptor neurons in C. elegans. Cell. 54, 5-16 (1988).
- Kamath, R. S., Fraser, A. G., Dong, Y., Poulin, G., Durbin, R., Gotta, M., Kanapin, A., Bot, N. L. e., Moreno, S., Sohrmann, M. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295, 2456-2459 (2002).
