Utilisation de l'interféron γ-enzymatique de dosage immunoenzymatique pour caractériser les nouveaux épitopes de lymphocytes T de virus du papillome humain

Résumé

La caractérisation des épitopes T des agents pathogènes responsables d'infections localisées, comme le papillomavirus humain, représente un défi en raison du nombre limité de lymphocytes T en circulation. Une méthode est décrite, permettant l'isolement et la caractérisation de lymphocytes T rares à partir d'un très faible nombre de cellules.

Résumé

Un protocole a été mis au point pour surmonter les difficultés liées à l'isolement et à la caractérisation de rares lymphocytes T spécifiques de pathogènes, tels que le papillomavirus humain (HPV), responsables d'infections localisées. Les étapes impliquées consistent à identifier la ou les régions des protéines du HPV contenant un ou plusieurs épitopes pour les lymphocytes T chez un sujet donné, à sélectionner les lymphocytes T spécifiques des peptides en se basant sur la sécrétion d'interféron-γ (IFN-γ), puis à cultiver et caractériser les clones de lymphocytes T (Fig. 1). Le sujet 1 était un patient récemment diagnostiqué avec une lésion intraépithéliale squameuse de haut grade par biopsie et ayant subi une conisation par boucle diathermique le jour même du prélèvement des lymphocytes T¹. Une région des protéines E6 et E7 du papillomavirus humain de type 16 (HPV 16) contenant un épitope pour les lymphocytes T a été identifiée à l’aide d’un test ELISPOT (enzyme-linked immunospot) mesurant l’IFN-γ, réalisé avec des peptides synthétiques chevauchants (Fig. 2). Les données de ce test ont permis non seulement d’identifier une région contenant un épitope pour les lymphocytes T, mais aussi d’estimer le nombre de lymphocytes T spécifiques de cet épitope et de les isoler en fonction de leur sécrétion d’IFN-γ, à l’aide de billes magnétiques commerciales (kit d’isolement des lymphocytes T CD8, Miltenyi Biotec, Auburn CA). Les lymphocytes T sécrétant l’IFN-γ sélectionnés ont été dilués et cultivés individuellement en présence d’un mélange de cellules nourricières irradiées afin de favoriser la croissance d’un seul lymphocyte T par puits. Ces clones de lymphocytes T ont été criblés à l’aide d’un test ELISPOT mesurant l’IFN-γ, en présence de peptides recouvrant la région identifiée et de cellules B lymphoblastoïdes autologues transformées par le virus d’Epstein-Barr (LCLs, obtenues comme décrit par Walls et Crawford)², afin de réduire au minimum le nombre de cellules nécessaires par clone. Plutôt que d’utiliser les 1 x 10⁵ cellules par puits habituellement employées dans les tests ELISPOT^1,3, seulement 1 000 cellules du clone de lymphocytes T en présence de 1 x 10⁵ LCLs autologues ont été utilisées, réduisant ainsi de façon spectaculaire le nombre de cellules requises. Les LCLs autologues ont servi non seulement à présenter les antigènes peptidiques aux cellules du clone de lymphocytes T, mais aussi à maintenir une densité cellulaire élevée dans les puits, permettant aux cellules du clone spécifiques de l’épitope de sécréter l’IFN-γ. Ceci garantit la réussite du test ELISPOT mesurant l’IFN-γ. De manière similaire, des tests ELISPOT mesurant l’IFN-γ ont été utilisés pour caractériser la séquence peptidique minimale et optimale de l’épitope pour les lymphocytes T CD8 (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) ainsi que son élément de restriction de classe I du CMH (B58). Le test ELISPOT mesurant l’IFN-γ a également été réalisé en utilisant des LCLs autologues infectées par un virus vaccinia exprimant la protéine E6 ou E7 du HPV 16. Le résultat a démontré que l’épitope T du E6 était traité de façon endogène. La reconnaissance croisée de l’épitope T homologue d’autres types de HPV à haut risque a été mise en évidence. Cette méthode peut également être utilisée pour décrire des épitopes pour les lymphocytes T CD4⁴.

Protocole

En réalisant un dosage ELISPOT de l'IFN-γ avec une lignée de cellules T CD8 établie à partir du sujet 1, on a déterminé que la région HPV 16 E6 46-70 contenait un épitope pour les cellules T¹ (Fig. 2), et les cellules T spécifiques de cet épitope ont été sélectionnées en fonction de leur sécrétion d'IFN-γ avant le début de ce protocole (Fig. 1).

1. Dilution limitante de lymphocytes T spécifiques d'épitope

1. Préparez le mélange de cellules nourricières en combinant des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) allogéniques irradiées (4 000 rad) à 5 x 10⁵ cellules/ml, d....

Discussion

Traditionnellement, les immunologistes tentaient de caractériser de nouveaux épitopes T en stimulant les lymphocytes T d'intérêt in vitro, puis en réalisant une expérience de dilution limitante afin d'isoler les clones de lymphocytes T spécifiques de l'épitope. Ensuite, les clones de lymphocytes T étaient caractérisés à l'aide d'un test de libération de chrome ^8,9. Toutefois, de nombreuses tentatives se sont révélées infructueuses, car la fréquence des lymphocytes T pouvait être trop faible pour perme.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kit d'isolement des cellules T CD8	Miltenyi Biotec	130-094-156
Phytohémagglutinine	Remel, Thermo Fisher Scientific	R-30852801	2 mg/vial
Milieu de Yssel’s	Gemini Bio Products	400-102	Sérum humain poolé à 1 %
Plaque 96 puits à fond rond	BD Biosciences	08-772-17
Interleukine-2 humaine recombinante	R&D Systems	202-IL-050	50μg
Plaque 24 puits	Corning	07-200-84
Solution saline tamponnée au phosphate	Cellgro	MT-21-031-CV
Anticorps monoclonal primaire anti-IFN-γ (D1K)	Mabtech	3420-3-1000
Anticorps monoclonal anti-IFN-γ conjugué à la biotine (7B-6)	Mabtech	3420-6-1000
Plaque ELISPOT Multiscreen HA	EMD Millipore	MAHA S45 10
Diméthylsulfoxyde	Sigma-Aldrich	D2650	Flacon de 100 ml
Sérum humain poolé	Atlanta Biologicals	S40510H	Inactiver par la chaleur
RPMI 1640	Cellgro	MT-10-040-CV
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287-100ml
Kit Vectastain Elite ABC	Vector Laboratories	NC9313719
Diaminobenzidine stable	Open Biosystems	MBI 1241
Lecteur ELISPOT AID EliSpot Reader Classic	Autoimmun Diagnostika GmbH	ELR06